Most studies involving the Langendorff apparatus use small animal models due to the increased complexity of systems for larger mammals. We describe a Langendorff system for large animal models that allows for use across a range of species, including humans, and relatively easy data acquisition.
Siden introduktionen i slutningen af det 19. århundrede, har Langendorff isolerede hjerte perfusionsapparat, og den efterfølgende udvikling af den arbejdende hjerte model, været uvurderlige værktøjer til at studere kardiovaskulær funktion og sygdom 1-15. Selvom Langendorff hjerte præparat kan bruges til alle pattedyr hjerte, de fleste undersøgelser, der involverer dette apparat bruge små dyremodeller (fx mus, rotte og kanin) på grund af den øgede kompleksitet i systemer til større pattedyr 1,3,11. En stor vanskelighed er at sikre en konstant koronar perfusion pres over en række forskellige hjerte størrelser – en vigtig komponent i ethvert eksperiment udnytte denne enhed 1,11. Ved at erstatte den klassiske hydrostatiske afterload søjle med en centrifugal pumpe, Langendorff arbejder hjertet beskrevet nedenfor, giver mulighed for nem justering og stram regulering af perfusionstryk, hvilket betyder det samme sæt-up kan anvendes til forskellige species eller hjerteproblemer størrelser. Endvidere kan denne konfiguration også problemfrit skifte mellem konstant tryk og konstant flow under reperfusion, afhængig af brugerens præferencer. Den åbne karakter af denne opsætning, trods gør temperaturregulering sværere end andre design, giver mulighed for nem samling af spildevand og ventrikulære tryk-volumen-data.
Meget af vores forståelse af grundlæggende hjerte-biologi og fysiologi er kommet fra forsøg, der udnyttede den isolerede, retrograd-perfunderet Langendorff hjerte og de isolerede arbejdsvilkår hjerte-systemer. Disse eksperimentelle systemer er stadig meget udbredt i dag at udvide vores hjerte-kar-viden om vigtige emner, herunder iskæmi-reperfusionsskade 2, klargøring, 4, cellebaserede terapi for beskadiget myokardiet 5,7, de kardiale effekter af narkotika 6,9 og hjerte-allotransplantat konservering teknikker 8,15-18.
Mens både isolerede hjerte-systemer kan anvendes til enhver pattedyrart, er de anvendes primært på små pattedyr, såsom marsvin, rotte eller kanin 3,12,13. Større dyremodeller, såsom svin og mennesker, give mere klinisk relevante data, men er mindre hyppigt anvendt på grund af højere omkostninger, større biologisk variation, større mængder af blod perfusionsopløsninger og Biggis stykker udstyr 1,12-15. Desuden er sværere dataindsamling, især for isolerede arbejdsvilkår hjerter 1,3,12-15. Som et resultat af disse kompleksiteter, er klinisk relevante isolerede hjerte modeller sjældent brugt, alvorligt hæmmer udviklingen af hjerte-kar-translationel forskning.
I et forsøg på at løse disse komplekse, blev isoleret arbejder hjerte forberedelse modificeres til at skabe et system, der let kan tilpasses til hjerter af forskellige arter, herunder mennesker, under enten konstant tryk eller konstant flow Langendorff forhold. Den afterload overholdelse kammer blev udskiftet med en centrifugalpumpe til at forenkle processen med at justere perfusionstryk i Langendorff mode og afterload i at arbejde tilstand. I stedet for en lukket, kappe reservoir til at indeholde i hjertet, dette system bruger et åbent kammer for at gøre indsamling af data lettere ved at muliggøre brug af transapical fremgangsmåde for ledningsevne kateterisation. Moreovis, denne åbne design giver adgang for ekkokardiografisk vurdering af hjertet, ved yderligere at udvide de fysiologiske parametre, der kan måles i løbet af disse eksperimenter. Disse forbedringer vil forhåbentlig anspore andre til at bruge dette system til store dyr translationel forskning.
Den Langendorff isolerede hjerte perfusionsapparat og arbejde hjerte model har ført til nogle af de mest grundlæggende opdagelser i hjertets fysiologi, patologi og farmakologi. Denne model alsidighed tillader dets anvendelse med en række forskellige arter under en række af normale og patologiske tilstande 1-18. Men den isolerede hjerte modellen ikke almindeligt anvendt til store pattedyr, især menneskers hjerter, delvist på grund af den øgede kompleksitet i både apparater design og dataindsamling. Derfor protokol præsenteret heri viser et forsøg på at forbedre disse kompleksiteter, der resulterer i en relativt reproducerbare middel til at studere isolerede svin hjerter.
Et afgørende element i vores setup er udskiftning af arterielle compliance / afterload kammer med en centrifugalpumpe. Denne udveksling giver mulighed for øget kontrol af koronar perfusion pres og afterload i Langendorff og arbejdsvilkår hjerte modes, respectively, tillader dette set-up til at være let tilpasses til hjerter i forskellige størrelser og arter. For eksempel, i dette design, er svin hjerter reperfunderes på 40-45 mmHg, mens menneskelige hjerter er reperfunderes på 60-65 mmHg. Denne ændring i tryk opnås blot ved at justere indstillingerne for centrifugal pumpe Ingen komponent i systemet skal være fysisk justeres. Endvidere placerer en tryktransducer i aortaroden at overvåge root pres muliggør nem overgang mellem konstant flow og konstant tryk under Langendorff tilstand. Selv om denne ændring fjerner den klassiske overholdelse kammeret centrifugalpumpen, ved at tillade tovejsstrømning sker baseret på trykgradienten, kan tjene som en overholdelse kammer. Med systole og skubbes slagvolumen, retrograd strømning over pumpen tjener til at mindske afterload tryk, replikerende aorta elasticitet.
Den åbne konstruktion af dette apparat er også vigtig. Når hjertet hænger i en åben etrea, i stedet for en semi-lukket kammer eller tragt, giver mulighed for lettere instrumentering til tryk-volumen målinger. Det åbne design muliggør brugen af en transapical snit for LV kateter placering, så man undgår den transvalvular tilgang. Den transvalvular fremgangsmåde er mere teknisk vanskeligt, og kræver som regel gennemlysning for korrekt placering. Endvidere kan denne tilgang også fremkalde valvular insufficiens. Ved at bruge transapical tilgang, vi sikkert og nemt placere kateteret i den venstre ventrikel og samtidig fjerne de ekstra udgifter og besvær med gennemlysning. Det åbne design giver også nem adgang til ekkokardiografi og spildevand indsamling, yderligere at udvide de funktionelle og biokemiske parametre, som kan vurderes, mens på dette system.
Det åbne design, samtidig lette dataindsamling, gør myokardie temperatur regulering vanskeligere. Fastholdelse fysiologisk temperatur er en af de kendte problemer med Langendorffeller arbejder hjerte-systemet 1,3,11,13. Det Langendorff Systemet indeholder typisk et termisk kammer, der bidrager til at opretholde en passende temperatur, men dette kammer gør også indsættelse af en ventrikel tryk-volumen kateter vanskeligere. For at løse den ringere temperatur regulering af det åbne design blev et oxygenator / varmeveksler placeret efter reservoiret. Den minimale afstand mellem varmeveksler og aorta kanyle reducerer varmetabet og myokardie temperatursonden sikrer normotermi. Anvendelsen af kappe slanger eller eksterne varmekilder kan også bruges til at hjælpe med temperaturkontrol.
En anden unik element i denne protokol vasker autolog blod grisen under studiet og rekonstituere den med normalt saltvand. Selv om anvendelsen af enten helblod perfusater eller røde blodlegemer augmented med krystalloide buffere er ikke ualmindeligt, det gør til stede med problemer. Den tidligere normalt kræver en donor dyr, som tilføjer substantial omkostninger for eksperimentet, mens sidstnævnte kan have immunogenicitet spørgsmål, da det normalt er afledt af okseblod 1,11-13. Ved at vaske den oprindelige gris eget blod, kun protokollen kræver et enkelt dyr og immunogenicitet spørgsmål ablated. Også vaskeprocessen fjerner de fleste af de elektrolytter, hvilket betyder at de let kan manipuleres pr eksperimentelle parametre. Endelig giver en bevarelse blodenhed fjerner de fleste af de proteiner i blodet, hvilket er både en fordel og ulempe ved denne proces. Fordelen er, at enhver koagulation og immunologiske / infektiøse proteiner fjernes, mindske risikoen for blodpropper eller forurening. Ulempen er, at denne blanding har et lavt onkotisk tryk, som kan føre til myocardial ødem og eventuelt tab af hjertefunktionen over tid. Dette problem kan løses imidlertid ved tilsætning af albumin eller anden kolloid.
Sikring af, at en korrekt størrelse enimal og kateter er blevet valgt, er lige så vigtig som at bruge fungere hjerte apparat. Ideelt vil kateteret placeres med alle følerelektroderne inde i ventrikulære rum, med to excitation elektroder (dvs. de mest proximale elektroder) uden for den ventrikulære rum. Hvis dyret ventrikulære hulrum er for lille eller afstanden mellem elektroderne er for stor, vil alle segmenter vil ikke passe ind i LV plads. Mens placeringen af excitation elektroder kan justeres, kan en lille LV hulrum også forårsage kateteret til at bøje eller kurve, hvilket gør indsamlingen af data vanskelig. Til funktionel analyse af store dyr hjerter, er et dyr størrelse på mindst 60 kg anbefales derfor. Med et dyr af denne størrelse elektrode afstand på 7 mm normalt giver mulighed for fuldstændig indsættelse af kateteret.
Afslutningsvis dette manuskript beskriver et isoleret arbejder hjerte system, der forenkler perfusionstryk regulering, data colsamlings og overordnede design, samtidig med at temperaturkontrol kun lidt mere vanskeligt. Disse ændringer til den isolerede arbejder hjerte vil forhåbentlig give mulighed for øget forbrug med store pattedyr hjerter, herunder mennesker, at fremme vores forståelse af hjerte patologi og muliggør mere klinisk relevante behandlingsmuligheder at blive opdaget.
The authors have nothing to disclose.
There are no acknowledgments.
PowerLab 16/35 with LabChart Pro | ADInstruments | PL3516/P | |
MPVS Ultra Pressure-Volume Unit | ADInstruments | 880-0168 | |
Ventri-Cath Catheter (5F, 12E, 7mm, DField, Straight, 122cm) | Millar | VENTRI-CATH-507s | |
Pressure Catheter (3.5F, Single, Straight, 100cm, Ny, Non Repairable) | Millar | SPR-524 | |
PV Extension Cable (10ft) | ADInstruments | CEC-10PV | |
Catheter Interface Cable (10ft) | ADInstruments | PEC-10D | |
Rho Calibration Cuvette | ADInstruments | 910-1060 | |
MPVS Ultra BNC Cable Pack | ADInstruments | 880-0172 | |
Autotransfusion system | Sorin | 7320000 | |
Bowl Set with Low Volume (135 ml) Centrifuge Bowl | Sorin | 7135100 | |
Oxygenator/Heat Exchanger | Terumo | 3CXSX18RX | |
Perivascular flow probe | Transonic Systems | PAU Series | Size of flow probe will depend on animal size; for 60 kg pig, recommend 20 or 24 mm probe |
Perivascular flowmeter module | Transonic Systems | TS420 | |
Myocardial temerpature sensor | Smiths Medical | MTS-40015 | |
16 G 1" Regular needle | BD Inc. | 305197 | |
4-0 polypropylene suture (double-arm) | Ethicon | 8526H | For purse-string stitches |
2-0 polypropylene suture (single-arm) | Ethicon | 8833H | |
Cable ties | ULINE | S-1021 | |
Cable tie gun | ULINE | H-241 | |
Clear, Flexible PVC Tubing | VWR International | 89068 | Inner diameter depends on cannulas, pumps and other equipment used; most commonly use 1/4", 3/8" tubing |
Straight Tubing Connectors | VWR International | 46600 | |
Y-Shaped Tubing Connectors | Thermo Scientific | 6152 | |
Jacketed Bubble Trap | Radnoti | 14040 | For preload chamber |
Centrifugal pump | Maquet | 70105 | The centrifugal pump and roller pumps were obtained used from perfusion department after clinical use. |
Roller pumps | Maquet | HL-20 | |
Hemostasis Valve | Merit Medical | MAP150 | |
Blood gas analyzer | Instrumentation Laboratory | 570001000 |