La detección in situ de las células T CD4 Autoreactive en Cerebro y Corazón Uso Mayor de Histocompatibilidad clase II Dextramers
Summary
El protocolo para detectar células autorreactivas T CD4 en el cerebro y el corazón mediante tinción directa con complejo mayor de histocompatibilidad de clase II dextramers se ha descrito en el presente informe. Para el análisis integral, un método fiable para enumerar las frecuencias de células T CD4 + específicas de antígeno in situ también se ideó.
Abstract
This report demonstrates the use of major histocompatibility complex (MHC) class II dextramers for detection of autoreactive CD4 T cells in situ in myelin proteolipid protein (PLP) 139-151-induced experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in SJL mice and cardiac myosin heavy chain-α (Myhc) 334-352-induced experimental autoimmune myocarditis (EAM) in A/J mice. Two sets of cocktails of dextramer reagents were used, where dextramers+ cells were analyzed by laser scanning confocal microscope (LSCM): EAE, IAs/PLP 139-151 dextramers (specific)/anti-CD4 and IAs/Theiler’s murine encephalomyelitis virus (TMEV) 70-86 dextramers (control)/anti-CD4; and EAM, IAk/Myhc 334-352 dextramers/anti-CD4 and IAk/bovine ribonuclease (RNase) 43-56 dextramers (control)/anti-CD4. LSCM analysis of brain sections obtained from EAE mice showed the presence of cells positive for CD4 and PLP 139-151 dextramers, but not TMEV 70-86 dextramers suggesting that the staining obtained with PLP 139-151 dextramers was specific. Likewise, heart sections prepared from EAM mice also revealed the presence of Myhc 334-352, but not RNase 43-56-dextramer+ cells as expected. Further, a comprehensive method has also been devised to quantitatively analyze the frequencies of antigen-specific CD4 T cells in the ‘Z’ serial images.
Introduction
El uso de complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) de clase II tetrámeros para la detección de las células CD4 T específicas de antígeno ha sido un reto 1-7. Para aumentar la sensibilidad de detección de MHC de clase II tetrámeros, el equipo de investigación ha creado tetrámeros de próxima generación, denominados "dextramers" 8. Dextramers contienen cadenas principales de dextrano en el que se conjugan múltiples restos de estreptavidina-fluoróforo, de manera que varios monómeros, MHC-péptido biotinilados atado se pueden unir a una molécula de dextrano 9. Por lo tanto, grandes agregados de dextramers MHC que contienen varios complejos de MHC-péptido pueden interactuar con múltiples receptores de células T (TCR).
Este grupo recientemente generada dextramers para diversos antígenos propios y demostró que la sensibilidad de detección de dextramers fue aproximadamente cinco veces más que los tetrámeros 8. Los sistemas experimentales incluyen encefalomielitis autoinmune experimental (EAE) inducida con proteína proteolípido (PLP) 139-151 en ratones SJL; EAE inducida con glicoproteína de mielina de oligodendrocitos (MOG) 35-55 en ratones C57BL / 6; y miocarditis autoinmune experimental (EAM) inducida con miosina cardíaca cadena pesada-α (MyHC) 334-352 en ratones A / J. Este estudio demuestra el uso de PLP139b151 – y MyHC 334-352 dextramers para detectar células T CD4 específicas de antígeno in situ con especificidad por el desarrollo de un protocolo de tinción directa, eliminando así la necesidad de amplificar las señales del uso de anticuerpos de fluoróforo, una enfoque empleado comúnmente con el uso de tetrámeros. Además, un método integral de evaluación de los tejidos también se ha ideado para enumerar de forma fiable las frecuencias de células T CD4 específicas de antígeno in situ 10. La detección de células T específicas de antígeno in situ permite la delineación de eventos causados por estímulos antigénicos específicos de las causadas por la activación espectador. Del mismo modo, la técnica de in situ en también providES oportunidades para realizar un seguimiento de la cinética de infiltraciones de células T específicas de antígeno en los órganos diana.
Protocol
Representative Results
Discussion
A diferencia de tetrámeros de MHC de clase I, el uso de MHC de clase II tetrámeros para aplicaciones de rutina sigue siendo un reto, especialmente para enumerar las frecuencias precursoras de baja afinidad autorreactivos células T CD4, debido en parte a su dependencia de activación 6,15-17. Recientemente, este problema se evitó mediante la creación de la próxima generación de tetrámeros, llamado "dextramers," que nos permite detectar células T CD4 específicas de antígeno para un número …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por la Miocardiopatía la Fundación del Niño (SDG2462390204001) American Heart Association y, y los Institutos Nacionales de Salud (HL114669). CM es un beneficiario de una beca de investigación postdoctoral concedida por la Fundación La miocarditis, NJ.
Materials
| CFA | Sigma Aldrich, St Louis, MO | 5881 | Store at 4οC |
| MTB H37Rv extract | Difco Laboratories, Detroit, MI | 231141 | Store at 4οC |
| PT | List Biologicals Laboratories, Campbell, CA | 181 | Store at 4οC |
| 1x PBS | Corning, Manassas, VA | 21-040-CV | Store at 4οC |
| Female A/J mice | Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME | 646 | |
| Female SJL/J mice | Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME | 686 | |
| Leur-lok sterile 1 ml syrringe | BD, Franklin Lakes, NJ | 309628 | |
| Leur-lok sterile 3 ml syrringe | BD, Franklin Lakes, NJ | 309657 | |
| Sterile needle, 18 G | BD, Franklin Lakes, NJ | 305195 | |
| Sterile needle, 27 1/2 G | BD, Franklin Lakes, NJ | 305109 | |
| 3-way stopcock | Smiths Medical ASD, Inc. Dublin, OH | MX5311L | |
| Kerlix gauze bandage rolls | Covidien, Mansfield, MA | 6720 | |
| Kimwipes | Kimberly-Clark Professional, Roswell, GA | 34155 | |
| Agarose, Low Melting Point, Analytical Grade | Promega corporation, Madison, WI | V2111 | |
| Immunopure normal goat serum | Thermo Scientific, Waltham, MA | 31873 | Store at -20 οC |
| Anti-mouse CD4 conjugated with PE dye | eBioscience, San Diego, CA | 12004185 | Store at 4οC |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA | 19202 | Store at 4οC |
| Faramount Aqueous Mounting Medium | Dako, Carpinteria, CA | 10073021 | |
| Conical tube (15ml) | BD Biosciences, San Jose, CA | 352099 | |
| Conical tube (50 ml) | BD Biosciences, San Jose, CA | 352070 | |
| 24-well flat bottomed tissue culture plates | BD Biosciences, San Jose, CA | 356775 | |
| Water color #2 brushes | Charles Leonard, Inc. Hauppauge, NY | 73502 | |
| Plain Microscope slides, size: 3" x 1" x 1.2 mm | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | 1255010 | |
| Premium Cover glass, 22 x 22-1 | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | 12548B | |
| Disposable deep base mold histology cassettes | Laboratory prodcust, Rochester, NY | M-475-10 | |
| Loctite Super glue | Henkel Corporation, Westlake, OH | 1471879 | |
| Razor blades | Gillette SuperSilver | ||
| Myhc-a 334-352 (DSAFDVLSFTAEEKAGVYK) | Neopeptide, Cambridge, MA | Store at 4οC | |
| PLP 139-151 (HSLGKWLGHPDKF) | Neopeptide, Cambridge, MA | Store at 4οC | |
| MHC class II/IAs PLP 139-151 or TMEV 70-86 dextramers conjugated with APC dye | Store at 4οC | ||
| MHC class II/IAk Myhc 334-352 or or RNase 40-56 dextramers conjugated with APC dye | Store at 4οC | ||
| Dextran conjugated SA-APC | Immundex, Copenhagen, Demark | Store at 4οC | |
| Sterile surgical scissors and forceps | INOX tool Corporation | ||
| Micro oven | GE Healthcare, Pittsuburgh, PA | ||
| Leica VT 1200 Vibratome | Leica Microsystems, Inc. Buffalo Grove, IL | ||
| Olympus BX 60 Laser scanning confocal microscope | Olympus America, Inc. Center Valley, PA | ||
| Nikon A1-Eclipse 90i confocal microscope | Nikon Inc. Melville, NY |
References
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