복구하는 새로운 미세 절제 접근<em> 결핵균</em폐 육아종 임베디드 포르말린 고정 파라핀에서> 특정 성적 증명서
Summary
미세 절제가 광범위하게 조직 내에서 DNA, RNA, 단백질의 시험을 위해 사용되어왔다. 레이저 캡처 현미경 (LCM)는 가장 일반적으로 사용되는 방법이지만 새로운 밀링 기술 mesodissection는 최근 유효하다. 우리는 mesodissected 포르말린 고정 파라핀 결핵균 육아종의 내장 조직 슬라이드에서 RNA 추출을 보여줍니다.
Abstract
미세 절제는 십년에 대한 DNA, RNA 및 단백질 수준에서의 조직 검사를 위해 사용되어왔다. 레이저 캡처 현미경 (LCM)는 오늘 사용되는 가장 일반적인 미세 절제 기법입니다. 이 기술에서, 레이저 focally 탈수 조직 섹션 1 위에 놓 열가소성 막을 용해하는 데 사용됩니다. 조직 절편 복합체이어서 들리고 막으로부터 분리된다. 이 기법은 조직 검사를 위해 성공적으로 사용될 수 있지만, 시간 소모적이고 비싸다. 또한,이 기술을 이용하여 절차의 성공적인 완료 따라서 그 사용을 제한하는, 레이저의 사용을 필요로한다. mesodissection라는 새 더 저렴하고 실용적인 미세 절제 방식은 LCM의 함정에 가능한 솔루션입니다. 이 기술은 밀에 장착 된 슬라이드 조직 샘플에서 원하는 조직을 MESO-1/MeSectr 시스템을 채택에 동시에 원하는 조직 샘플을 복구하는 유체 분배 및 흡인하면서소모품 밀 비트. 해부 과정을 시작하기 전에, 사용자는 (FFPE) 포함 된 포르말린 고정 파라핀 (H & E) 기준 슬라이드 스테인드 헤 마톡 실린 및 에오신으로 밀어 맞 춥니 다. 그 후, 오퍼레이터는 소망 해부 영역에 주석 및 해당 세그먼트를 해부로 진행한다. 이 프로그램은 절개의 아카이브 이미지를 생성합니다. mesodissection의 가장 큰 장점은이 실험에서 세대를 샘플링하기 위해 설정 10 분 거리의 평균을 복용, 슬라이드를 해부하는 데 필요한 짧은 기간입니다. 또한,이 시스템은 훨씬 더 효과적인 비용과 사용자 친화적이다. 약간의 단점은 레이저 캡처 현미경처럼 정확하지 않습니다 것입니다. 이 문서에서 우리는 mesodissection은 결핵균 (Mtb의)에 의해 발생 FFPE의 육아종에서 슬라이드에서 RNA를 추출하는 방법을 보여줍니다.
Introduction
샘플은 전통적으로 수동으로 전체 조직이나 바늘과 메스를 사용하여 슬라이드 하나에서 microdissected되었습니다. 이것은 그 조직의 부와 주변 조직의 2 항 사이의 명확한 분리를 필요로한다. 분자 프로파일 기술에서 현재 발전으로, 세포 수준에서 조직을 평가할 필요성이 증가되고있다. 때문에 수동 미세 절제의 제한, LCM 등의 기술이 큰 절연 정밀도 수 있도록하기 위하여 설립되었다. 이 기술은 다음과 같은 연구가 유전자 발현 프로파일 링과 같은 하류 분석법에 사용할 수있는 다양한 세포 및 슬라이드 타입으로부터 특정 세포 집단을 분리 할 수있다. 다운 스트림 분석에 매우 효과적이지만, LCM은 제한이없는 것은 아니다. 첫째, LCM은 비용과 시간이 소요되는 과정입니다. 또한, 때문에 RNA의 불안정한 특성으로 종종 LCM 샘플 2에서 고품질의 RNA를 얻기 위해 도전하고있다. 때문에 디에LCM의 sadvantages은, 미세 절제 기술의 새로운 발전은 여전히 저렴하고 시간에 민감한 방법으로 연구자의 큰 숫자에 더 접근 할 수 있도록하기 위해 필요합니다.
사용할 미세 절제 기술의 하나의 발전은 mesodissection로 알려진 기술이다. 이 기술에서 기계 공장 관심 주석 조직 섹션을 사용하고 소모품 밀 비트 3에를 흡입한다. 다음에,이 샘플 포집 관으로 흡인하고 다운 스트림 애플리케이션에 사용될 수있다. 이 시스템의 장점은 훨씬 적은 비용과 시간이 중요한 것이있다. 우리의 경험에서, 시스템 10 분의 폐 육아종 조직 부분의 절개를 할 수 있습니다. 한편, 기존의 LCM 가능성 프로세스를 완료하기 위해 시간을 필요로한다. 시스템은 오퍼레이터에 대한 주석의 비교뿐만 아니라 도구로 사용하는 기준 슬라이드를로드 할 수있다. 또한 보고서는 개요 일을 생성해부 된 슬라이드의 전자 영역입니다. mesodissection하는 두 가지 주요 단점이 있습니다. 복수의 셀을 추출하는데 효과적이지만, 그것은 하나의 세포를 분리하기 위해 도전. 또, 생성 된 화상의 정밀도는 다른 촬상 현미경을 사용하는 경우만큼 명확하지 않다.
결핵 (TB)는 주요 전염병 전세계 인류의 킬러와 Mtb의 감염의 결과입니다. 결핵균 에어로졸에 노출 된 개인의 대부분에서, 감염은 잠재적으로 제한됩니다. 매년 적어도 천만명에서, 활동성 결핵 4가 발생합니다. 잠복 감염시, Mtb의는 육아종로 알려진 병적 인 폐 병변 내에 포함되어 있습니다. 따라서 그것의 mtb 감염의 결과를 육아종 5 수준에서 결정되고 있다고 주장하고있다.
여기에서 우리는 mesodissection는 Mtb의에 의한 육아종을 microdissect하는 데 사용할 수있는 방법을 보여줍니다. 사용 된 슬라이드감염된 붉은 털 원숭이에서 FFPE의 폐 조직에서이다. 이 데모의 목적을 위해, 우리는 그 전체 육아종 해부 것이다. 또한 RNA가 회복 조직으로부터 추출 될 수 있다는 것을 보여준다. 이 기술은 다양한 다른 표본으로부터 조직 샘플에인가하고 하류 분석법 다양한 위해 사용될 수있다.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mesodissection 병원균의 광대 한 배열로 인한 병적 병변 슬라이드로부터 RNA 추출에 적용 할 수있는 기법이다. 이것은 사용자가 콘텐츠를 추적하고 정확하게 이미지를 정렬 필요성이다. 이 작업을 수행하기 위해 장비는 이미징 소프트웨어의 지침에 따라 보정해야합니다. 해부 할 때 해부하고 그 슬라이드와 영역이 정렬되지 않는 경우, 사용자는 장비를 다시 교정해야합니다. 해부 과정에서 또 다른 ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
R01HL106790, R01HL106790-S1, R01HL106786, R01AI089323, R21AI091457, R21RR026006, P20RR020159, C06RR017563, 8T32OD011124-08, 및 P51OD011104 : 저자는이 연구의 지원에 대해 다음 NIH 상 / subawards을 인정하고 싶습니다.
Materials
| MeSectr | AvanSci Bio | Mesodissector | |
| 400 nm xScisors | AvanSci Bio | Other sizes available | |
| THOR | AvanSci Bio | Programmable Heater-Shaker | |
| NanoDrop2000 | ThermoScientific | ND-2000 | |
| RNeasy FFPE extraction kit | Qiagen | 73504 | |
| Ovation RNA-Seq FFPE System | Nugen | 7150 | |
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 |
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