미세 절제가 광범위하게 조직 내에서 DNA, RNA, 단백질의 시험을 위해 사용되어왔다. 레이저 캡처 현미경 (LCM)는 가장 일반적으로 사용되는 방법이지만 새로운 밀링 기술 mesodissection는 최근 유효하다. 우리는 mesodissected 포르말린 고정 파라핀 결핵균 육아종의 내장 조직 슬라이드에서 RNA 추출을 보여줍니다.
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이 논문에서
정오 공지
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요약
초록
미세 절제는 십년에 대한 DNA, RNA 및 단백질 수준에서의 조직 검사를 위해 사용되어왔다. 레이저 캡처 현미경 (LCM)는 오늘 사용되는 가장 일반적인 미세 절제 기법입니다. 이 기술에서, 레이저 focally 탈수 조직 섹션 1 위에 놓 열가소성 막을 용해하는 데 사용됩니다. 조직 절편 복합체이어서 들리고 막으로부터 분리된다. 이 기법은 조직 검사를 위해 성공적으로 사용될 수 있지만, 시간 소모적이고 비싸다. 또한,이 기술을 이용하여 절차의 성공적인 완료 따라서 그 사용을 제한하는, 레이저의 사용을 필요로한다. mesodissection라는 새 더 저렴하고 실용적인 미세 절제 방식은 LCM의 함정에 가능한 솔루션입니다. 이 기술은 밀에 장착 된 슬라이드 조직 샘플에서 원하는 조직을 MESO-1/MeSectr 시스템을 채택에 동시에 원하는 조직 샘플을 복구하는 유체 분배 및 흡인하면서소모품 밀 비트. 해부 과정을 시작하기 전에, 사용자는 (FFPE) 포함 된 포르말린 고정 파라핀 (H & E) 기준 슬라이드 스테인드 헤 마톡 실린 및 에오신으로 밀어 맞 춥니 다. 그 후, 오퍼레이터는 소망 해부 영역에 주석 및 해당 세그먼트를 해부로 진행한다. 이 프로그램은 절개의 아카이브 이미지를 생성합니다. mesodissection의 가장 큰 장점은이 실험에서 세대를 샘플링하기 위해 설정 10 분 거리의 평균을 복용, 슬라이드를 해부하는 데 필요한 짧은 기간입니다. 또한,이 시스템은 훨씬 더 효과적인 비용과 사용자 친화적이다. 약간의 단점은 레이저 캡처 현미경처럼 정확하지 않습니다 것입니다. 이 문서에서 우리는 mesodissection은 결핵균 (Mtb의)에 의해 발생 FFPE의 육아종에서 슬라이드에서 RNA를 추출하는 방법을 보여줍니다.
서론
샘플은 전통적으로 수동으로 전체 조직이나 바늘과 메스를 사용하여 슬라이드 하나에서 microdissected되었습니다. 이것은 그 조직의 부와 주변 조직의 2 항 사이의 명확한 분리를 필요로한다. 분자 프로파일 기술에서 현재 발전으로, 세포 수준에서 조직을 평가할 필요성이 증가되고있다. 때문에 수동 미세 절제의 제한, LCM 등의 기술이 큰 절연 정밀도 수 있도록하기 위하여 설립되었다. 이 기술은 다음과 같은 연구가 유전자 발현 프로파일 링과 같은 하류 분석법에 사용할 수있는 다양한 세포 및 슬라이드 타입으로부터 특정 세포 집단을 분리 할 수있다. 다운 스트림 분석에 매우 효과적이지만, LCM은 제한이없는 것은 아니다. 첫째, LCM은 비용과 시간이 소요되는 과정입니다. 또한, 때문에 RNA의 불안정한 특성으로 종종 LCM 샘플 2에서 고품질의 RNA를 얻기 위해 도전하고있다. 때문에 디에LCM의 sadvantages은, 미세 절제 기술의 새로운 발전은 여전히 저렴하고 시간에 민감한 방법으로 연구자의 큰 숫자에 더 접근 할 수 있도록하기 위해 필요합니다.
사용할 미세 절제 기술의 하나의 발전은 mesodissection로 알려진 기술이다. 이 기술에서 기계 공장 관심 주석 조직 섹션을 사용하고....
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프로토콜
사단 이미징 소프트웨어를 사용하여 1. 보정 Mesodissection 악기
사단 이미징 소프트웨어는이 문서의 나머지 부분에 대한 소프트웨어 또는 프로그램 중 하나라고한다. 이 단계는 정확하게 화상을 추적 할뿐만 아니라, 다수의 슬라이드 프레임을 정렬하는 데 필요하다.
- 악기와 컴퓨터를 켭니다.
- 오픈 소프트웨어 및 "보정기구"를 선택합니다.
- 조이스틱을 사용하여 스테이지 이동을 보정합니다. 왼쪽 상단 위치로 무대를 이동합니다. 프로그램의 1 단계를 눌러 "설정".
- 올바른 위치를 낮은 단계로 이동합니다. 프로그램의 2 단계를 눌러 "설정".
- 먼저 헤드 어셈블리를 높이기 위해 "Z 버튼"을 눌러 포부를 보정합니다. 조이스틱을 눌러 "대기음 펄스"버튼과 "해부"버튼을 플런저 제어봉까지 최고 위치에 도달. 프로그램의 3 단계에서 "SET"키를 누르면,.
- 을 눌러 "대기음 리셋과# 8221; 버튼을 누릅니다. 플런저는 4 단계에서 아래의 위치를 눌러 "설정"에서 정지되면.
- "규모 탭"을 클릭합니다.
- 빈면에 교정 통치자를 놓습니다.
- 필요한 경우 현미경 초점을 맞 춥니 다.
- ....
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결과
상기 프로토콜은 FFPE 조직 슬라이드에서 RNA를 추출하는 새로운 mesodissection 기술을 사용하는 방법을 보여줍니다. 이 프로토콜의 효능은 다양한 감염 단계에서 Mtb의 감염 NHP에서 폐 육아종의 FFPE 슬라이드를 통해 표시됩니다. 1-3 악기. 그림 4의 이미지 들이고 해부 프로세스가 발생하는 방법을 묘사하고 소프트웨어. 표 1에 의해 생성 된 결과 이미지 각각의 감염 상태에서 NHP에서 육아종와 RNA 추출의 결과를 보여줍니다. RNA가 증폭 및 16S (표 2-4)의 RT-PCR 증거를 허용하도록 정제 하였다. 표 4 따라서 Mtb의 리보솜 소단위 16S의 존재를 확인하고, 상기 Mtb, microdissected 샘플.
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토론
Mesodissection 병원균의 광대 한 배열로 인한 병적 병변 슬라이드로부터 RNA 추출에 적용 할 수있는 기법이다. 이것은 사용자가 콘텐츠를 추적하고 정확하게 이미지를 정렬 필요성이다. 이 작업을 수행하기 위해 장비는 이미징 소프트웨어의 지침에 따라 보정해야합니다. 해부 할 때 해부하고 그 슬라이드와 영역이 정렬되지 않는 경우, 사용자는 장비를 다시 교정해야합니다. 해부 과정에서 또 다른 중요한 단계는 이전의 해부 (5.1 단계)에 거품이없는 상태가되도록하는 방식으로 소비 밀 비트를로드하는 것입니다. 우리는 거품의 존재가 해부 수율을 감소한다는 것을 발견했다. 이 문제를 해결하기 위해, 우리는 여러 번 추진과 플런저를 표현하는 것이 좋습니다. 사용자는 제조업체에서 권장하는, 거품을 시각화하는 연습 버퍼에 식용 색소를 추가하여 연습 할 수 있습니다. 유효하면, 사용자는 통상의 절개를 진행한다. 라세인트 중요한 단계는 반 시계 방향으로 샘플을 해부하는 것입니다. 반 시계 방향의 기계 선반; 따라서, 우리는 반대 방식으로 원.......
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공개 사항
저자는 더 경쟁 금전적 이해 관계가 없음을 개시한다.
감사의 글
R01HL106790, R01HL106790-S1, R01HL106786, R01AI089323, R21AI091457, R21RR026006, P20RR020159, C06RR017563, 8T32OD011124-08, 및 P51OD011104 : 저자는이 연구의 지원에 대해 다음 NIH 상 / subawards을 인정하고 싶습니다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| MeSectr | AvanSci Bio | 메소디스섹터 | |
| 400 nm xScisors | AvanSci Bio | 다른 크기도 사용 가능 | |
| THOR | AvanSci Bio | 프로그래밍 가능한 히터-쉐이커 | |
| NanoDrop2000 | ThermoScientific | ND-2000 | |
| RNeasy FFPE 추출 키트 | Qiagen | 73504 | |
| Ovation RNA-Seq FFPE 시스템 | Nugen | 7150 | |
| QIAquick PCR 정제 키트 | 키아겐 | 28104 |
참고문헌
- Fend, F., Raffeld, M. Laser capture microdissection in pathology. J Clin Pathol. 53 (9), 666-672 (2000).
- Esposito, G. Complementary techniques: laser capture microdissection--increasing specificity of gene expression profiling of cancer spe....
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재인쇄 및 허가
정오
Formal Correction: Erratum: A Novel Microdissection Approach to Recovering Mycobacterium tuberculosis Specific Transcripts from Formalin Fixed Paraffin Embedded Lung Granulomas
Posted by JoVE Editors on 7/01/2014. Citeable Link.
The corresponding author was changed for the article, A Novel Microdissection Approach to Recovering Mycobacterium tuberculosis Specific Transcripts from Formalin Fixed Paraffin Embedded Lung Granulomas. The corresponding author was changed from:
Teresa A. Hudock
to:
Deepak Kaushal
