טכני אלמנטים בסיסיים של ההקפאה-בר / הקפאה-לחרוט בביולוגי מיקרוסקופית אלקטרונים
Summary
טכניקות וחידודים של עיבוד הקפאה שבר של דגימות ביולוגיות וננו לבדיקה על ידי מיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים בסיסיים מתוארות. טכניקה זו היא שיטה מועדפת לחשיפת תכונות והתמחויות של ממברנות ביולוגיות ultrastructural ולקבלת נתונים ממדיים ומרחבי רמת ultrastructural במדעי חומרים ומוצרי ננוטכנולוגיה.
Abstract
להקפיא בר / להקפיא לחרוט מתאר תהליך שבו דגימות, בדרך כלל ביולוגי או nanomaterial בטבע, הם קפואים, שבר, ומשוכפל ליצירת פחמן / פלטינה "להפיל" המיועד לבדיקה על ידי מיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים. דגימות נתונים לשיעורי הקפאת ultrarapid, לעתים קרובות בנוכחות סוכני cryoprotective להגביל היווצרות גבישי קרח, עם השבירה הבאה של הדגימה בחנקן נוזלי מקוררת טמפרטורות תחת ואקום גבוה. המשטח סדוק התוצאה משוכפל והתייצב על ידי אידוי של פחמן ופלטינה מזווית שמקנה משטח פירוט תלת ממדי לשחקנים. טכניקה זו הוכיחה מאיר עיניים במיוחד לחקירה של קרום תא וההתמחויות שלהם ותרמה במידה ניכרת להבנה של צורה סלולרית לתפקוד תא קשור. בדוח זה, נסקור את דרישות המכשיר ופרוטוקול טכני לביצועהקפאה שבר, המינוח ומאפיינים של מטוסי שבר הקשורים, וריאציות על ההליך המקובל, וקריטריונים לפרשנות של תמונות להקפיא בר. טכניקה זו נמצאת בשימוש נרחב לחקירת ultrastructural בתחומים רבים של ביולוגיה של תא וטומנת בחובו הבטחה כטכניקת הדמיה המתעוררות למולקולרית, ננוטכנולוגיה, ולימודי מדע חומרים.
Introduction
הרעיון והיישום מעשי של עיבוד הקפאה שבר של דגימות ביולוגיות הוצג על ידי 1 סטיר יותר ממחצית לפני מאה שנה. המנגנון המוקדם ניכס רכיבים שונים ליחידה עצמאית עובדת 1. המנגנון המקורי שונה ומעודן לתוך מכשירים זמינים באופן מסחרי במטרה לענות על הצורך הקריטי במניפולציה מרחוק, תחזוקה של ואקום גבוה, והאידוי של פחמן ומתכות כדי לייצר העתק מתאים לבדיקה על ידי מיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים (איור 1 ואיור 2).
המכשיר הטיפוסי מורכב של תא ואקום גבוה עם שולחן דגימה וזרוע microtome יש תפוקת חנקן נוזלית regulable (איור 1). התא כולל גם שני רובי אלקטרונים, אחד לייצוב אידוי פחמן ממוקם בזווית 90 מעלות לשלב דגימה והאחרת לPlatinum / פחמן הצללה בזווית מתכווננת, בדרך כלל 15º – 45º (איור 2). כוח ליחידה מוחל לתפעול משאבת הוואקום ולוחות אלקטרוניים לווסת שליטת התאמת הטמפרטורה ואלקטרון אקדח.
הגה במקור כאמצעי להשגת הדמיה משופרת של וירוסים, להקפיא-שבר זכה לפופולריות עוד יותר כטכניקה לבחינה והניתוח של קרום תא וההתמחויות שלהם 2, 3. ואכן, הליך זה היה בלתי נפרד מהבהרת יחסי מבנה / תפקוד בתאים וברקמות ורבים מהמחקרים האלה עומדים כמו תרומות קלאסיות לביולוגיה מולקולרית של תא 4-9. המטרה העיקרית והרציונל לפיתוח של טכניקת הקפאה-השבר היה להגביל חפצים נצפים ברזולוציה מיקרוסקופית אלקטרונים הנובעות מקיבעון כימי והעיבוד השתמש במיקרוסקופ אלקטרונים ביולוגי קונבנציונלי. כאן המטרה היא להגביל כימיקיבעון ולהקפיא את הדגימה במהירות מספקת, ולעתים קרובות בנוכחות cryoprotectant כדי להגביל את היווצרות גבישי קרח וחפצי הקפאה אחרות. לאחרונה, בטכניקה זו מצאה התעוררות מחודשת של עניין מביולוגים מולקולריים וחוקרי מדע חומרים לבדיקה של חלקיקים וננו.
תמונות בהקפאה שבר ולהקפיא לחרוט מפגינות אופי תלת ממדים ולעתים טועים לmicrographs אלקטרונים הסורקים. עם זאת, הכנות להקפיא בר נבחנות על ידי מיקרוסקופי אלקטרונים הולכה והתרומה הגדולה שלהם ללימודים מורפולוגיים ברזולוציה גבוהה היא הייצוג הייחודי שלהם של אלמנטי מבנה / תפקוד של קרום תא. עיבוד בהקפאה שבר הוא ביוזמת הקפאת תאים ורקמות במהירות מספיקה כדי להגביל את התגבשות קרח ו / או בשימוש בסוכנים cryoprotectant כגון גליצרול. לאחר מכן הדגימות שבר תחת ואקום ונציגLica מופק על ידי אידוי של פחמן ופלטינה על פני השטח שהברים. הדגימה המקורית מתעכלת מההעתק שמאוחזר על רשת דגימת EM סטנדרטית. עוד פירוש מוטעה נפוץ של תמונות להקפיא בר הוא שהם מתארים משטחי תא. עם זאת ההנחה הבסיסית של הקפאה שבר היא שקרומים ביולוגיים מפוצלים דרך bilayer השומנים על ידי תהליך שבר (איור 3). תהליך בקרומים ביולוגיים זה מניב שני פרצופים שבר, אחד החושף את הארגון של מחצית מהקרום הסמוך אל הציטופלסמה,-PF הפנים, ואחד אשר חושף את מחצית עלון bimolecular של הקרום שנמצאה בסמוך לתאי הסביבה,-EF הפנים. משטחי תא אמיתיים אינם מיוצגים בתמונות להקפיא בר אך מופיעים רק כאשר הצעד שנוסף לאחר הקפאת תחריט ביצוע הליך שבר משמש. כדי לחרוט ביעילות דגימות שבר בעבר כדי לחשוף detai משטחl, דגימות חייבות להיות קפוא בקצב מהיר וללא unetchablecryoprotectant. תחריט של מים מפני השטח של הדגימה שבר חושפת תכונות הבסיסיות מושגת על ידי הצבת זרוע קירור microtome מעל הבמה דגימת יצירת ההפרש טמפרטורה בין השלב מחזיק את הדגימה וזרוע microtome הקירור אשר גורמת למים נשגבים מהמשטח. כאשר מים בסובלימציה מפני השטח של הדגימה שבר במהלך תמרון תחריט ההקפאה, אז היבטים של משטחים בפועל תא, מטריצת חוץ תאית, מבני cytoskeletal, והרכבות מולקולריות עשויים להתגלות ברזולוציה גבוהה. כך בהקפאה שבר ולהקפיא לחרוט אינן תנאים להחלפה, אלא משקף את תהליך צעד חכם האחרונה שבם לא עשוי להיות נחוץ או רצוי בהתאם לצרכים של מחקר המסוים.
בעקבות ההקפאה-הבר / להקפיא לחרוט נהלים, המשטחים הסדוקים חשופים לevapora המכווןtive שכבות של פחמן ופלטינה על מנת לספק תמיכה והדמיה ניגוד להעתק. אידוי ההדמיה / פחמן הפלטינה יכול להיות חד כיווני או סיבובי, והוא נעשה על ידי או התנגדות או רובי אלקטרונים. הצללה חד כיווני מזווית ידועה, בדרך כלל 30º – 45º, היא שימושית בביצוע חישובי morphometric מסוימים. דגימות שהיו נתונים לעמוקים תחריט בדרך כלל הן סיבוביות מוצל והתמונות כתוצאה של דגימות אלה מתהפכות photographically להערכה.
ההיסטורי, כמו גם מטרה הנוכחית של הקפאה שבר טכניקת ההקפאה לחרוט / היא להגביל קיבעון כימי ועיבוד דגימת ממצאים הקשורים ליותר נהלים במיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים קונבנציונליים. עם זאת, טכניקה זו מספקת יתרון מהותי ביכולתה להעניק פירוט תלת ממדים ובכך להקל על רכישה של נתונים morphometric במדע ביולוגי, חומר, וnדגימות anotechnology. נהלי ההקפאה שבר ולהקפיא לחרוט הם מורכבים ורבי פנים והיבטים מסוימים של היישום שלה מותאמים אישית. מצגת זו מציעה נוף סקר של התכונות העיקריות של התהליך והקורא מופנה לפרוטוקולים שפורסמו מקיפים 10, 11 על מנת לתת מענה לפרטים ולהתאמה אישי של התהליך לצרכי מחקר ספציפיים.
Protocol
Representative Results
Discussion
בשנים שלאחר השקתו וזמינות מסחרית, הקפאה שבר / נהלים לחרוט נוצלו באופן נרחב לחקירות של מבנה קרום ביולוגי. ואכן, נקודות המבט הטובות ביותר של חלק מההתמחויות המבניות של קרומים התקבלו בהכנות להקפיא בר / לחרוט. מחקרים אלה לא רק תרמו להבנה של המבנה הארגוני של ממברנות אלא גם ס?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This presentation was supported by a Clinical Innovator Award to JLC from the Flight Attendant Medical Research Institute and by the United States Environmental Protection Agency. Although the research described in this article has been funded wholly or in part by the United States Environmental Protection Agency through Cooperative Agreement CR83346301 with the Center for Environmental Medicine, Asthma, and Lung Biology at The University of North Carolina at Chapel Hill, it has not been subjected to the Agency’s required peer and policy review, and therefore does not necessarily reflect the views of the Agency and no official endorsement should be inferred. Mention of trade names or commercial products does not constitute endorsement or recommendation for use.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Balzers Freeze-fracture/freeze-etch plant | Balzers | BAF400T | |
| Standard buffers | various suppliers | ||
| standard aldehyde fixatives | various suppliers | ||
| sodium dichromate | various suppliers | ||
| sulfuric acid | various suppliers | ||
| Disposable supplies for Platinum/Carbon Evaporation | Technotrade International | ||
| Liquid nitrogen | various suppliers | ||
| Freon | various suppliers | ||
| Disposable supplies for electron microscopy | Electron Microscopy Sciences | ||
| Transmission electron microscope | Carl Zeiss Inc. |
References
- Steere, R. L. Electron microscopy of structural detail in frozen biological specimens. J Biophysic and BiochemCytol. 3, 45-60 (1957).
- Pinto da Silva, P., Branton, D. Membrane splitting in freeze-etching. Covalently bound ferritin as a membrane marker. J Cell Biol. 45, 598-605 (1970).
- Friend, D. S., Gilula, N. B. Variations in tight and gap junctions in mammalian tissues. J Cell Biol. 53, 758-776 (1972).
- Branton, D. Fracture faces of frozen membranes. ProcNatlAcadSci USA. 55, 1048-1056 (1966).
- Heuser, J. E., Reese, T. S., Dennis, M. J., Jan, Y., Jan, L., Evans, L. Synaptic vesicleexocytosiscaptured by quick freezing and correlated with quantal transmitter release. J Cell Biol. 81, 275-300 (1979).
- Goodenough, U. W., Heuser, J. E. Substructure of inner dynein arms, radial spokes, and the central pair/projection complex of cilia and flagella. J Cell Biol. 100, 2008-2018 (1985).
- Goodenough, U. W., Heuser, J. E. Substructure of the outer dynein arm. J Cell Biol. 95, 798-815 (1982).
- Hirokawa, N., Heuser, J. E. Quick-freeze, deep-etch visualization of the cytoskeleton beneath surface differentiations of intestinal epithelial cells. J Cell Biol. 91, 399-409 (1981).
- Hirokawa, N. Quick freeze, deep etch of the cytoskeleton. Methods Enzymol. 134, 598-612 (1986).
- Chandler, D. E., Sharp, W. P., Kuo, J. o. h. n. Freeze fracture and freeze etching. Electron Microscopy: Methods and Protocols. Methods in Molecular Biology. 1117, 95-132 (2014).
- Severs, N. J. Freeze-fracture electron microscopy. Nature Protocols. 2, 547-576 (2007).
- Gilula, N. B., Satir, P. The ciliary necklace. A ciliary membrane specialization. J Cell Biol. 53, 494-509 (1972).
- Rohatgi, R., Snell, W. J. The ciliary membrane. CurrOpin Cell Biol. 22, 541-546 (2010).
- Fisch, C. F., Dupuis-Williams, P. Ultrastructure of cilia and flagella-back to the future. Biol Cell. 103, 249-270 (2011).
- Carson, J. L., Collier, A. M., Knowles, M. R., Boucher, R. C., Rose, J. G. Morphometric aspects of ciliary distribution and ciliogenesis in human nasal epithelium. Proc Nat Acad Sci. 78, 6996-6999 (1981).
- Carson, J. L., Collier, A. M., Smith, C. A. New observations on the ultrastructure of mammalian conducting airway epithelium: Application of liquid propane freezing and rotary shadowing techniques to freeze-fracture. J Ultrastr Res. 89, 23-33 (1984).
- Carson, J. L., Collier, A. M., Gambling, T. M., Leigh, M. W., Hu, S. S., Boat, T. F. Development organization, and function of tight junctional complexes in the tracheal epithelium of infant ferrets. Am Rev Respir Dis. 138, 666-674 (1988).
- Coyne, C. B., Gambling, T. M., Boucher, R. C., Carson, J. L., Johnson, L. G. Role of claudin interactions in airway tight junctional permeability. Am J Physiol. 285, 1166-1178 (2003).
- Carson, J. L., Collier, A. M., Hu, S. S. Ultrastructural studies of hamster tracheal epithelium in vivo and in vitro. J Ultrastr Res. 70, 70-81 (1979).
- Carson, J. L., Collier, A. M., Knowles, M. R., Boucher, R. C. Ultrastructural characterization of epithelial cell membranes in normal human conducting airway epithelium: A freeze-fracture study. Am J Anat. 173, 257-268 (1985).
- Charles, A. C., Naus, C. C. G., Zhu, D., Kidder, G. M., Dirksen, E. R., Sanderson, M. J. Intercellular calcium signaling via gap junctions in glioma cells. J Cell Biol. 118, 195-201 (1992).
- Sanderson, M. J., Charles, A. C., Dirksen, E. R. Mechanical stimulation and intercellular communication increases intercellular CA2+ in epithelial cells. Cell Regul. 1, 585-596 (1990).
- Welsch, F., Stedman, D., Carson, J. L. Effects of a teratogen on [3H]uridine nucleotide transfer between human embryonal cells and on gap junctions. Exp Cell Res. 159, 91-102 (1985).
- Carson, J. L., Willumsen, N. J., Gambling, T. M., Hu, S. S., Collier, A. M. Dynamics of intercellular communication and differentiation in a rapidly developing mammalian airway epithelium. Am J Respir Cell & Molec Biol. 1, 385-390 (1989).
- Carson, J. L., Collier, A. M., Clyde, W. A. Ciliary membrane alterations occurring in experimental Mycoplasma pneumoniae infection. Science. 206, 349-351 (1979).
- Carson, J. L., Collier, A. M., Hu, S. S. Ultrastructural observations on cellular and subcellular aspects of experimental Mycoplasma pneumoniae disease. Infect & Immun. 29, 1117-1124 (1980).
- Henshaw, N. G., Carson, J. L., Collier, A. M. Ultrastructural observations of Pneumocystis carinii attachment to rat lung. J Infect Dis. 151, 181-186 (1985).
- Carson, J. L., Collier, A. M., Hu, S. S. The appearance of compound cilia in the nasal mucosa of normal human subjects in response to acute, low level sulfur dioxide exposure. Environ Res. 42, 155-165 (1987).
- Carson, J. L., Collier, A. M., Gambling, T. M., Knowles, M. R., Boucher, R. C. Ultrastructure of airway epithelial cell membranes among patients with cystic fibrosis. Hum Pathol. 21, 640-647 (1990).
- Carson, J. L., Brighton, L. E., Collier, A. M., Bromberg, P. A. Correlative ultrastructural investigations of airway epithelium following experimental exposure to defined air pollutants and lifestyle exposure to tobacco smoke. InhalToxicol. 25, 134-140 (2013).
- Boonstra, J., et al. Immunocytochemical demonstrations of cytoplasmic and cell-surface EGF receptors in A431 cells using cryo-ultramicrotomy, surface replication, freeze-etching and label fracture. J Microscopy. 140, 119-129 (1985).
- Fujimoto, K. Freeze-fracture replica electron microscopy combined with SDS digestion for cytochemical labeling of integral membrane proteins. Application to the immunogold labeling of intercellular junctional complexes. J. Cell Sci. 108, 3443-3449 (1995).
- Quinn, P. J. The effect of tocopherol on the structure and permeability of phosphatidylcholine liposomes. J Control Release. 160, 158-163 (2012).
