जैविक इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी में रुक फ्रैक्चर / रुक खोदना की मौलिक तकनीकी तत्वों
Summary
बुनियादी तकनीकों और ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी द्वारा परीक्षा के लिए जैविक नमूनों और nanomaterials के फ्रीज फ्रैक्चर प्रसंस्करण के शोधन वर्णित हैं. इस तकनीक ultrastructural सुविधाओं और जैविक झिल्लियों की विशेषज्ञताओं खुलासा करने के लिए और सामग्री विज्ञान और नैनो उत्पादों में ultrastructural स्तर आयामी और स्थानिक डेटा प्राप्त करने के लिए एक पसंदीदा तरीका है.
Abstract
प्रकृति में नमूनों, आम तौर पर जैविक या nanomaterial, खंडित, जमे हुए, और एक कार्बन / प्लैटिनम "डाली" ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी द्वारा परीक्षा के लिए करना उत्पन्न करने के लिए दोहराया है जिससे फ्रीज फ्रैक्चर / फ्रीज खोदना एक प्रक्रिया का वर्णन करता है. नमूने तरल नाइट्रोजन उच्च वैक्यूम के तहत तापमान ठंडा पर नमूना के बाद fracturing के साथ, अक्सर बर्फ क्रिस्टल के गठन को सीमित करने cryoprotective एजेंटों की उपस्थिति में, ultrarapid ठंड दरों के अधीन हैं. परिणामी खंडित सतह दोहराया और कलाकारों के लिए सतह के तीन आयामी विस्तार प्रदान कि एक कोण से कार्बन और प्लैटिनम के वाष्पीकरण से स्थिर है. इस तकनीक कोशिका झिल्ली और उनकी विशेषज्ञता की जांच के लिए विशेष रूप से ज्ञानवर्धक साबित कर दिया है और सेल से संबंधित कार्य करने के लिए सेलुलर फार्म को समझने के लिए काफी योगदान दिया है. इस रिपोर्ट में, हम प्रदर्शन के लिए साधन की आवश्यकताओं और तकनीकी प्रोटोकॉल सर्वेक्षणफ्रीज फ्रैक्चर, जुड़े नामकरण और फ्रैक्चर विमानों की विशेषताओं, फ्रीज फ्रैक्चर छवियों की व्याख्या के लिए पारंपरिक प्रक्रिया में बदलाव, और मापदंड. इस तकनीक का व्यापक रूप से कोशिका जीव विज्ञान के कई क्षेत्रों में ultrastructural जांच के लिए इस्तेमाल किया और आणविक, नैनो के लिए एक उभरती इमेजिंग तकनीक के रूप में वादा रखती है, और सामग्री विज्ञान के अध्ययन किया गया है.
Introduction
अवधारणा और जैविक नमूनों की फ्रीज फ्रैक्चर प्रसंस्करण के व्यावहारिक अनुप्रयोग एक सदी पहले आधी से अधिक Steere 1 द्वारा पेश किया गया था. जल्दी तंत्र काम कर रहे एक घुन्ना इकाई 1 में असमान घटक विनियोजित. मूल उपकरण संशोधित और दूरदराज के हेरफेर, उच्च वैक्यूम के रखरखाव के लिए महत्वपूर्ण जरूरत को समायोजित करने के क्रम में व्यावसायिक रूप से उपलब्ध उपकरणों में परिष्कृत, और कार्बन और धातुओं के वाष्पीकरण ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (चित्रा 1 और चित्रा ने परीक्षा के लिए उपयुक्त एक प्रतिकृति उत्पादन किया गया था 2).
ठेठ साधन नमूना तालिका और सूक्ष्म बांह नियम तरल नाइट्रोजन throughputs होने (चित्रा 1) के साथ एक उच्च निर्वात चैम्बर के होते हैं. चैम्बर भी नमूना चरण के लिए एक 90 º कोण और Plati के लिए अन्य पर तैनात कार्बन वाष्पीकरण स्थिर रखने के लिए दो इलेक्ट्रॉन बंदूकें, एक मकान45 º (चित्रा 2) – एक समायोज्य कोण, आम तौर पर 15º पर ग्रहण संख्या / कार्बन. इकाई को सत्ता निर्वात पंप संचालित करने के लिए लागू किया जाता है और इलेक्ट्रॉनिक पैनल तापमान समायोजन और इलेक्ट्रॉन बंदूक नियंत्रण को विनियमित.
मूल रूप से परीक्षा और कोशिका झिल्ली का विश्लेषण और उनके विशेषज्ञताओं 2, 3 के लिए एक तकनीक के रूप में भी अधिक से अधिक लोकप्रियता हासिल फ्रैक्चर फ्रीज, वायरस के बेहतर इमेजिंग प्राप्त करने के लिए एक साधन के रूप में कल्पना की. दरअसल, इस प्रक्रिया कोशिकाओं और ऊतकों और इन अध्ययनों के कई सेल और आणविक जीवविज्ञान 4-9 क्लासिक योगदान के रूप में खड़े में संरचना / समारोह रिश्तों elucidating का अभिन्न अंग रहा है. फ्रीज फ्रैक्चर तकनीक के विकास के लिए प्रमुख लक्ष्य और तर्क पारंपरिक जैविक इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी में इस्तेमाल किया रासायनिक निर्धारण और प्रसंस्करण से पाने इलेक्ट्रॉन सूक्ष्म प्रस्ताव पर नमूदार कलाकृतियों को सीमित करने के लिए किया गया था. यहाँ लक्ष्य रासायनिक सीमित करने के लिए हैनिर्धारण पर्याप्त गति के साथ और अक्सर बर्फ क्रिस्टल के गठन और अन्य ठंड कलाकृतियों को सीमित करने के क्रम में एक cryoprotectant की उपस्थिति में नमूना जमा करने के लिए और. अभी हाल ही में इस तकनीक नैनोकणों और nanomaterials की परीक्षा के लिए आणविक जीव विज्ञान और सामग्री जांचकर्ताओं से ब्याज की एक पुनरुत्थान पाया गया है.
फ्रैक्चर रुक और फ्रीज खोदना छवियों को एक तीन आयामी चरित्र दिखा रहे हैं और कभी कभी स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन micrographs के लिए गलत कर रहे हैं. हालांकि, फ्रीज फ्रैक्चर तैयारी ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी द्वारा जांच कर रहे हैं और उच्च संकल्प शब्द के भागों के अध्ययन के लिए उनके महत्वपूर्ण योगदान कोशिका झिल्ली की संरचना / समारोह तत्वों की अपनी अनूठी प्रतिनिधित्व है. फ्रीज फ्रैक्चर प्रसंस्करण और / या ऐसे ग्लिसरॉल के रूप में cryoprotectant एजेंटों के उपयोग के साथ बर्फ क्रिस्टलीकरण सीमित करने के लिए पर्याप्त गति के साथ कोशिकाओं और ऊतकों ठंड द्वारा शुरू की है. नमूनों तो वैक्यूम और एक प्रतिनिधि तहत खंडित कर रहे हैंLica खंडित सतह पर कार्बन और प्लैटिनम का वाष्पीकरण द्वारा उत्पन्न होता है. मूल नमूना एक मानक ईएम नमूना ग्रिड पर लिया गया है जो प्रतिकृति से पच जाता है. फ्रीज फ्रैक्चर छवियों का एक अन्य आम अशुद्ध अर्थ वे सेल सतहों को दर्शाती है. फ्रीज फ्रैक्चर का मूल आधार जैविक झिल्लियों फ्रैक्चर प्रक्रिया (चित्रा 3) द्वारा लिपिड bilayer के माध्यम से विभाजित कर रहे हैं हालांकि. जैविक झिल्लियों में यह प्रक्रिया दो फ्रैक्चर चेहरे, कोशिकी के निकट है कि झिल्ली के bimolecular पुस्तिका के आधे से पता चलता है जो कोशिका द्रव्य, पीएफ-सामना करने के लिए आसन्न झिल्ली के आधे के संगठन का पता चलता है जो एक, और एक पैदावार परिवेश, एफई चेहरा. यह सच है कि सेल सतहों फ्रीज फ्रैक्चर छवियों में प्रतिनिधित्व लेकिन फ्रैक्चर प्रक्रिया के बाद फ्रीज नक़्क़ाशी के बाद जोड़ा कदम प्रयोग किया जाता है जब केवल प्रकट नहीं कर रहे हैं. प्रभावी ढंग से सतह Detai प्रकट करने के लिए पहले से खंडित नमूनों खोदना करने के क्रम मेंएल, नमूनों एक तीव्र दर से और unetchablecryoprotectant बिना जमे हुए किया जाना चाहिए. अंतर्निहित सुविधाओं खुलासा खंडित नमूना की सतह से पानी की नक़्क़ाशी नमूना पकड़े चरण के बीच एक तापमान अंतर पैदा नमूना चरण से अधिक ठंडा सूक्ष्म हाथ और सतह से उदात्त करने के लिए पानी का कारण बनता है, जो ठंडा सूक्ष्म हाथ स्थिति से पूरा किया है. पानी फ्रीज नक़्क़ाशी पैंतरेबाज़ी के दौरान खंडित नमूना की सतह से sublimed जाता है, तो वास्तविक सेल सतहों, बाह्य मैट्रिक्स, cytoskeletal संरचनाओं, और आणविक विधानसभाओं के पहलुओं को उच्च संकल्प पर पता चला जा सकता है. इस प्रकार फ्रीज फ्रैक्चर और खोदना फ्रीज विनिमेय शर्तें नहीं हैं बल्कि जो बाद के विशेष अध्ययन की जरूरत के आधार पर आवश्यक या वांछनीय नहीं हो सकता है एक कदम के लिहाज से इस प्रक्रिया को दर्शाते हैं.
फ्रीज फ्रैक्चर के बाद / फ्रीज खोदना प्रक्रियाओं, खंडित सतहों निर्देशित evapora के अधीन हैंप्रतिकृति को समर्थन और इमेजिंग विपरीत प्रदान करने के क्रम में कार्बन और प्लैटिनम की कोट ेश्य. प्लैटिनम / कार्बन इमेजिंग वाष्पीकरण यूनिडायरेक्शनल या रोटरी हो सकता है और प्रतिरोध या इलेक्ट्रॉन बंदूकों या तो द्वारा पूरा किया है. एक ज्ञात कोण, आम तौर पर 30º से यूनिडायरेक्शनल ग्रहण – 45 º, कुछ morphometric गणना प्रदर्शन करने में उपयोगी है. गहरे नक़्क़ाशी के अधीन किया गया है कि नमूने आमतौर पर छाया रोटरी हैं और इन नमूनों की परिणामी छवियों फ़ोटोग्राफ़ी मूल्यांकन के लिए उलट हैं.
ऐतिहासिक और साथ ही फ्रीज फ्रैक्चर / फ्रीज खोदना तकनीक के वर्तमान लक्ष्य अधिक पारंपरिक ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी प्रक्रियाओं के साथ जुड़े रहे हैं कि कलाकृतियों नमूना रासायनिक निर्धारण और प्रसंस्करण की सीमा है. हालांकि, इस तकनीक और एन, तीन आयामी विस्तार प्रदान करने और इस प्रकार जैविक, भौतिक विज्ञान में morphometric डेटा के अधिग्रहण की सुविधा के लिए अपनी क्षमता में एक ठोस लाभ प्रदान करता हैanotechnology नमूनों. फ्रैक्चर-रुक और फ्रीज खोदना प्रक्रियाओं जटिल और बहुआयामी हैं और अपने आवेदन के कुछ पहलुओं को अनुकूलित कर रहे हैं. इस प्रस्तुति प्रक्रिया की प्रमुख विशेषताओं में से एक सर्वेक्षण दृश्य प्रस्तुत करता है और पाठक विशिष्ट अनुसंधान की जरूरत के लिए प्रक्रिया विवरण को संबोधित करने और अनुकूलित करने के क्रम में व्यापक प्रकाशित प्रोटोकॉल 10, 11 के लिए भेजा है.
Protocol
Representative Results
Discussion
इसकी शुरूआत और वाणिज्यिक उपलब्धता के बाद के वर्षों में, फ्रीज फ्रैक्चर / खोदना प्रक्रियाओं को व्यापक रूप से जैविक झिल्ली संरचना की जांच के लिए उपयोग किया गया. दरअसल, झिल्ली की संरचनात्मक विशेषज्ञताओं ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This presentation was supported by a Clinical Innovator Award to JLC from the Flight Attendant Medical Research Institute and by the United States Environmental Protection Agency. Although the research described in this article has been funded wholly or in part by the United States Environmental Protection Agency through Cooperative Agreement CR83346301 with the Center for Environmental Medicine, Asthma, and Lung Biology at The University of North Carolina at Chapel Hill, it has not been subjected to the Agency’s required peer and policy review, and therefore does not necessarily reflect the views of the Agency and no official endorsement should be inferred. Mention of trade names or commercial products does not constitute endorsement or recommendation for use.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Balzers Freeze-fracture/freeze-etch plant | Balzers | BAF400T | |
| Standard buffers | various suppliers | ||
| standard aldehyde fixatives | various suppliers | ||
| sodium dichromate | various suppliers | ||
| sulfuric acid | various suppliers | ||
| Disposable supplies for Platinum/Carbon Evaporation | Technotrade International | ||
| Liquid nitrogen | various suppliers | ||
| Freon | various suppliers | ||
| Disposable supplies for electron microscopy | Electron Microscopy Sciences | ||
| Transmission electron microscope | Carl Zeiss Inc. |
References
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