기본 기술과 투과 전자 현미경에 의한 검사에 대한 생물 표본 및 나노 물질의 동결 골절 처리의 개선이 설명되어 있습니다. 이 기술은 미세 기능과 생체막의 전문을 공개 및 재료 과학 및 나노 기술 제품에 미세 수준의 차원과 공간 데이터를 얻기위한 바람직한 방법이다.
이 콘텐츠를 보려면 JoVE 구독이 필요합니다. 로그인하거나 오늘 무료 평가판을 시작하세요.
이 논문에서
요약
초록
자연 표본, 일반적으로 생물 또는 나노 재료, 골절, 냉동 및 탄소 / 백금 "캐스팅"투과 전자 현미경에 의한 검사 대상을 생성하기 위해 복제된다 동결 골절 / 동결 에칭 프로세스에 대해 설명합니다. 시료는 액체 질소가 고 진공 하에서 냉각 온도에서 시편의 후속 파쇄와 종종 얼음 결정의 형성을 제한하는 cryoprotective 에이전트의 존재 ultrarapid 동결 속도로 실시된다. 결과 절단면 복제 및 캐스트에 표면을 세 차원 세부 사항을 부여 각도에서 탄소와 백금의 증발에 의해 안정화된다. 이 기술은 세포막과 전문 분야의 조사를 위해 특히 계몽 입증했다 및 관련 세포의 기능을 세포 형태의 이해에 크게 기여하고있다. 이 보고서에서 우리는 수행하기위한 장비 요구 사항 및 기술적 프로토콜을 조사동결 골절, 관련 용어 및 파괴 평면의 특성, 동결 골절 이미지의 해석에 대한 기존의 절차에 대한 변화 및 기준. 이 기술은 널리 세포 생물학의 많은 지역에서 미세 구조 조사에 사용되는 분자, 나노 기술에 대한 새로운 이미징 기술 등의 약속을 보유하고, 재료 과학 연구되고있다.
서론
개념 및 생물학적 시료의 동결 골절 처리의 실용적인 응용 프로그램은 한 세기 전 반 이상 스티어 (1)에 의해 소개되었다. 초기 장치는 작업 자체에 포함 된 유닛 하나에 서로 다른 구성 요소를 충당. 원래 장치는 개질 및 원격 조작, 고진공의 유지를위한 중요한 요구를 수용하기 위해 상업적으로 이용 가능한 기기로 정제하고, 탄소 및 금속의 증발은 투과형 전자 현미경 (도 1 및도 검진 적합한 복제본을 생성시켰다 2).
전형적인 장비는 시료 테이블과 마이크로톰 팔 regulable 액체 질소 처리량을 갖는 (그림 1)과 높은 진공 챔버로 구성되어 있습니다. 챔버는 또한 시료 스테이지 90 ° 각도 plati위한 다른 위치에서 탄소 증발을 안정화 개의 전자총 번을 수납45 ° (그림 2) - 각도 조절, 일반적으로 15 °에 그림자 NUM / 탄소. 장치의 전원이 진공 펌프를 작동하기 위해 적용되며, 전자는 패널 온도 조정 및 전자총 제어를 조절한다.
원래 시험 및 세포막의 분석 및 그들의 전문이, 3 기술로서 더욱....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
프로토콜
동결 골절 / 냉동 에칭을위한 생물 표본의 1 준비
- 1 시간 동안 0.1 M 인산 버퍼에 기존의 EM 고정 제 제제와 같은 2 % 글 루타 알데하이드 (glutaraldehyde) + 2 % 파라 포름 알데히드를 사용합니다. 생체 조직의 기본 고정을 수행 할 수 있습니다. 참고 : 전에 고정하지 않고 표본의 몇 가지 유형을 동결하는 것이 바람직 할 수 있지만, 보편적 인 혈액 매개 병원균주의 시편은 인간의 조직으로 구성되어 적절한 고정을 의무화.
- 기본 고정에 따라, 더 이상 하나 이상의 시간 동안 0.2 M 자당으로 보충 같은 버퍼에 시편을 씻어.
- 1 시간보다 더 0.1 M 인산염 완충액에서 25 % 글리세롤로 이루어진 동결 방지제 용액에 시편을 전송.
동결 골절에 앞서 2 냉동 및 검체의 보관
- 적절한 크기와 시편 형상의 선택 금 또는 구리 시편 스텁이 처리되고 (그림 4 ).
- 미세 등급 겸자 및 / 또는 금속 시편 스텁 위에 시험편의 작은 게이지 주사기 바늘 위치 작은 조각을 사용.
- , 스티커로 시험편의 액체 함량을 감소 약간 여과지와 스터브의 가장자리에서 액체를 그려서 일관성 ....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
결과
동결 골절 화상 해석의 핵심 전제는 골절면이 규칙 PF - 얼굴 (플라즈마 골절면)와 EF-얼굴 (세포 외 골절면) (그림에 의해 호출이 골절의 얼굴을 부여하는 세포막의 지질 이중층을 통과한다는 것입니다 3). PF-얼굴 셀 EF-얼굴의 세포질에 인접 멤브레인 지질 이중층의 절반 엑스트라 셀룰러 인접 세포막 지질 이중층의 절반이다. 동결 골절 기술은 막 구조물의 조사에 특히 유용하고 두면은 일반적 PF-면을 적게 포함 EF-얼굴 달리 많은 멤브레인 연결된 입자로 채워지으로 명쾌 다르다. 동결 골절 세포의 세포질 내용은 외관에서 일반적으로 거친 아르와 같은 핵 및 골지체로 막 결합 소기관이 쉽게 식별 할 수 있지만, 특히 공개되지 않습니다. 특히 관심을 INVE합니다이 기술을 사용 stigators 그들의 기능에 대해 해석 될 수있는 막 구조의 특수화이다. 이러한 멤브레인 관련 입자의 특정 분포, 섬모 막 전문화 및 세포 간 접합을 포함한다.
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
토론
도입 및 상용화 다음 몇 년 동안, 동결 골절 / 에칭 과정은 널리 생물학적 막 구조의 연구에 활용 하였다. 실제로, 막 구조 전문의 일부 가장 관점 동결 골절 / 에칭 제제로 얻어졌다. 이러한 연구뿐만 아니라 세포막의 구조적 조직의 이해에 기여뿐만 아니라 구조와 기능이 관련되는 방법에 대한 통찰력을 제공했다.
루틴 생물학적 전자 현미경의 출현은 생물학적 시료에 차등 전자 밀도를 부여하기 위해 요구되는 알데히드 고정 제, 반응성 화학 물질, 중금속과 화학적 처리 자체가 아티펙트의 생성에 기여한다는 인식을 초래. 동결 골절 기술의 개발은 처리 아티팩트를 감소하기위한 노력에 부분적으로 기초 하였다. 그럼에도 불구하고, 그 동결 골절을 인정 받고/ 에칭 얼음 결정 손상하는 중요한 하나의 유물 자신의 세트를 소개합니다. 티슈 인해 미세 내용을 말살 얼음 결정의 형성을 초래 시험편을 둘러싼 질소 가스의 절연 층의 형성에 액체 질소 환경에 직접 환원 냉각 속도 급감. 이 문제는 글리.......
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
공개 사항
저자는 공개할 것이 없습니다.
감사의 글
이 프레젠테이션은 Flight Attendant Medical Research Institute와 미국 환경 보호국의 JLC에 대한 임상 혁신상(Clinical Innovator Award)의 지원을 받았습니다. 이 기사에 설명된 연구는 노스캐롤라이나 대학교 채플힐의 환경 의학, 천식 및 폐 생물학 센터와의 협력 협정 CR83346301 통해 미국 환경 보호국(United States Environmental Protection Agency)의 전체 또는 일부 자금을 지원받았지만, 미국 환경보호국(EPA)의 필수 동료 및 정책 검토를 거치지 않았습니다. 따라서 반드시 기관의 견해를 반영하는 것은 아니며 공식적인 보증을 추론해서는 안 됩니다. 상표명 또는 상용 제품에 대한 언급은 사용에 대한 보증 또는 권장 사항으로 간주되지 않습니다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 발저스 동결 파괴 / 동결 에칭 공장 | 발저스 | BAF400T | |
| 표준 버퍼 다양한 | 공급 업체 | ||
| 표준 알데히드 정착제 | 다양한 공급 업체 | ||
| 중크롬산 나트륨 | 다양한 공급 업체 | ||
| 황산, | 다양한 공급 업체 | ||
| 소모품 백금/탄소 증발, | Technotrade International | ||
| 액체, 질소 | 다양한 공급업체 | ||
| 프로판 | 다양한 공급업체 | ||
| 전자 현미경용 일회용 소모품 | , 전자 현미경 과학, | ||
| 투과, 전자 현미경 | Carl Zeiss, Inc. |
참고문헌
- Steere, R. L. Electron microscopy of structural detail in frozen biological specimens. J Biophysic and BiochemCytol. 3, 45-60 (1957).
- Pinto da Silva, P., Branton, D. Membrane splitting in freeze-etching. Covalently bound ferritin as a membrane mar....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재인쇄 및 허가
