Innsamling og Utvinning av spytt DNA for Next Generation Sequencing

Summary

DNA extraction from saliva can provide a readily available source of high molecular weight DNA, with little to no degradation/fragmentation. This protocol provides optimized parameters for saliva collection/storage and DNA extraction to be of sufficient quality and quantity for downstream DNA assays with high quality requirements.

Abstract

The preferred source of DNA in human genetics research is blood, or cell lines derived from blood, as these sources yield large quantities of high quality DNA. However, DNA extraction from saliva can yield high quality DNA with little to no degradation/fragmentation that is suitable for a variety of DNA assays without the expense of a phlebotomist and can even be acquired through the mail. However, at present, no saliva DNA collection/extraction protocols for next generation sequencing have been presented in the literature. This protocol optimizes parameters of saliva collection/storage and DNA extraction to be of sufficient quality and quantity for DNA assays with the highest standards, including microarray genotyping and next generation sequencing.

Introduction

Innhenting av høy kvalitet DNA for menneske genetiske studier er viktig i sykdomsgenet funnet prosessen. Blod, selv krever en invasiv prosedyre og også å være dyrere enn spytt samling, er foretrukket for å skape udødeliggjorte cellelinjer som uendelig kilde til DNA eller iPSCs for funksjonelle studier, og noen ganger blod-DNA blir brukt når cellelinjer som ikke er tilgjengelige. Men å skaffe blod krever et trenet phlebotomist og blod har en kortere halveringstid enn spytt ^en. DNA fra spytt er rimeligere og enklere å få tak i, siden det kan samles inn og sendes i posten uten behov for en phlebotomist, og dermed øke potensielle lagt bassenger godt utover nedslagsfeltet for sykehus og laboratorier ^to. Study påmelding kan forbedres når motivet har muligheten til å gi en spyttprøve i stedet for blod ^{3, 4.} Bekymringer om mengden og kvaliteten av DNA fra spytt kan ha begrenset sin omfattende osse til tross for tallrike studier nylige studier som viser egnetheten av hele spytt, med et gjennomsnitt på 4,3 x 10 ⁵ celler pr milliliter, etter DNA-testing over de eldre bukkale vattpinner metoder som ikke oppnår betydelige mengder av spytt ^{2, 3, 4, 5, 6..} Selv en beskjeden litteraturen eksisterer viser egnetheten av hele spytt avledet DNA for genotyping applikasjoner inkludert mikromatrisebasert metoder ^{8, 9, 10,} har ingen studier undersøkt neste generasjon sekvensering (NGS). Målet for optimalisering av hele denne spytt DNA-ekstraksjon protokollen var å maksimere kvantitet og kvalitet for genetikk applikasjoner på en kostnadseffektiv måte som er lett implementeres i laboratorier med felles reagenser og forbruksmateriell.

DNA-ekstraksjon fra spytt krever flere prosedyrer: 1) innsamling og lagring, 2) cellelyse, 3) RNase behandling, 4) protein nedbør, 5) etanol nedbør, 6) DNA rehydrering. DNA Stabilization Buffer løsning, beskrevettidligere ^2, funksjoner tilstrekkelig uten endringer. Ingen forsøk på å optimalisere RNase behandling og DNA rehydrering trinn ble laget. For hver gjenværende trinn ble flere variabler som kan påvirke avkastningen identifisert. Hver variabel ble manipulert individuelt og forbedring i utbytte og kvalitet ble vurdert statistisk. For variabler som ble vist å forbedre utbyttet og / eller DNA-kvalitet, ble de optimale verdier som inngår i den avsluttende protokoll.

Protocol

MERK: Før gi spyttprøver alle fag ga informert samtykke i samsvar med retningslinjene for behandling av mennesker på Nationwide Children Hospital. 1. Spytt innsamling og oppbevaring Før spytt samling, sikre at faget munn er fri for mat eller andre fremmede stoffer ved å ha faget skylle munnen med vann og unngå å spise eller drikke i 30 min før samle prøven. Åpne et 15 ml sentrifugerør med 2,5 ml av DNA-stabilisering buffer 2 å sørge for å unngå å berøre innsiden a…

Representative Results

For å bestemme optimale parametre for DNA-ekstraksjon en rekke sammenkoblede DNA ekstraksjon ble utført. En enkelt spyttprøve ble delt og hver del testet med en av to mulige verdier for en gitt variabel. Minst åtte replikater av hver sammenkoblet test ble utført (f.eks, ble en enkelt spyttprøve alikvotert å teste ekstraksjon både med og uten innledende 50 ° C inkubasjon). Optimalisering var basert på fire standard beregninger: total DNA avkastning, den 260/280 verdi, 260/230 verdi, og visuell inspeksj…

Discussion

Den foreliggende fremgangsmåte er en optimalisert DNA-ekstraksjon protokoll som har betydelig forbedret utbytte av høy molekylvekt-DNA sammenlignet med standardmetoder, uten at det går DNA-kvalitet. Den kritiske trinnet med størst effekt på yielden mest var trinn 5.2, som inkluderer en lengre sentrifuge trinnet under etanol nedbør enn noen publisert protokollen anmeldt her, bortsett fra en som ikke var allment distribuert ^11. Ingen endringer i DNA-kvalitet forbundet med denne lenger sentrifugering ble p…

Materials

15ml Centrifuge Tubes	Fisher	12-565-268
Cell Lysis Solution	Qiagen	158908
Proteinase K	Sigma	P6556
Protein Precipitation Solution	Qiagen	158912
Isopropanol	Fisher	A416-4
Glycogen	EZ-BioResearch	S1003
70% Ethanol	Fisher	04-355-305
Tris-EDTA (TE)	Fisher	BP2473-1
NaCl	Fisher	AC194090010
Tris HCl	Fisher	BP1757-100
EDTA(0.5M) Solution	Fisher	03-500-506
Sodium Dodecyl Sulfate	Fisher	BP166-100
Equipment
Name of Equipment	Distributor	Catalog#
Analog Vortex Mixer	Fisher	02-215-365
Centrifuge 5810R	Eppendorf	5811 000.010