Un protocollo Infettare<em> Caenorhabditis elegans</em> Con<em> Salmonella typhimurium</em
Summary
C. elegans è emerso come un nuovo modello genetico per studiare le interazioni ospite-patogeno. Qui si descrive un protocollo per infettare C. elegans con Salmonella typhimurium accoppiato con la tecnica RNAi doppio filamento interferenze per esaminare il ruolo dei geni ospitanti in difesa contro le infezioni da Salmonella.
Abstract
Nell'ultimo decennio, C. elegans è emerso come un organismo invertebrato per studiare le interazioni tra i padroni di casa e agenti patogeni, tra cui la difesa ospite contro i gram-negativi batterio Salmonella typhimurium. Salmonella stabilisce infezione persistente nell'intestino di C. elegans e si traduce in morte precoce di animali infetti. Un certo numero di meccanismi immunitari sono stati identificati in C. elegans per difendersi contro le infezioni da Salmonella. Autofagia, un evolutivamente conservata degradazione lisosomiale percorso, ha dimostrato di limitare la replica Salmonella in C. elegans e nei mammiferi. Qui, un protocollo è descritto per infettare C. elegans con Salmonella typhimurium, in cui i vermi sono esposti a Salmonella per un tempo limitato, simile alle infezioni da Salmonella nell'uomo. Salmonella infezione riduce notevolmente la durata di C. elegans </ Em>. Utilizzando il gene autofagia essenziale bec-1 come esempio, abbiamo combinato questo metodo infezione da C. elegans RNAi alimentazione approccio e ha mostrato questo protocollo può essere utilizzato per esaminare la funzione di C. geni ospitanti elegans in difesa contro le infezioni da Salmonella. Poiché C. elegans intero genoma librerie RNAi sono disponibili, questo protocollo permette di schermare completamente per la C. elegans geni che proteggono contro la salmonella e altri patogeni intestinali utilizzando le librerie RNAi genome-wide.
Introduction
Il nematode del suolo a vita libera Caenorhabditis elegans è un semplice e geneticamente trattabili organismo modello utilizzato per studiare molte questioni biologiche. C. elegans esiste prevalentemente come ermafroditi auto-fertilizzazione. I maschi sono spontaneamente generati da non disgiunzione del cromosoma X durante la gametogenesi 1,2. In presenza di cibo abbondante, C. elegans sviluppare continuamente attraverso quattro stadi larvali all'adulto. La temperatura influisce anche C. sviluppo elegans; sviluppo più rapido si osserva a temperature più elevate. In laboratorio, C. elegans è coltivato ad una temperatura standard di 20 ° C su piastre di agar con seminato batterio Escherichia coli (ceppo OP50) come alimento 1,2.
Nell'ultimo decennio, C. elegans è emerso come un organismo invertebrato per studiare le interazioni ospite-patogeno 3-5. In natura, C. elegans mangia i batteri come nutrient 1,2 fonte. La sua normale cibo laboratorio batterica, OP50, può essere facilmente sostituito con altri patogeni per esaminare le interazioni tra C. elegans e qualsiasi agente patogeno scelta. In queste condizioni, l'intestino è il sito primario dell'infezione. Infatti, una vasta gamma di patogeni batterici ha dimostrato di infettare lethally C. elegans 3-5.
Il batterio Salmonella gram-negativa è un agente patogeno gastrointestinale che causa malattie di origine alimentare umana in tutto il mondo 6,7. C. elegans è un buon modello di accoglienza per la Salmonella typhimurium come questo batterio si replica e presenta infezioni intestinali persistenti 8-10. C. elegans è stato usato per identificare sia nuovo e precedentemente noto virulenza di Salmonella fattori 11. È interessante notare che il C. sistema immunitario elegans limita con successo la replica Salmonella. E 'stato riportato in precedenza che inibition di geni autofagia rende maggiore la replica di Salmonella in C. elegans, con conseguente morte precoce di vermi infetti 10. Macroautofagia (di seguito denominato autofagia) è un processo dinamico che coinvolge il riassetto delle membrane subcellulari di sequestrare citoplasma e organelli per la consegna agli lisosomi per la degradazione 12. Autofagia è stato segnalato per limitare la replica Salmonella in C. elegans e nei mammiferi 10,13.
La C. elegans genoma è stato il primo genoma degli eucarioti multicellulari sequenziato; è sensibile alle RNAi trattamento 14-16. Inoltre, RNAi può essere somministrato efficacemente sottoponendo vermi ingerire batteri contenenti l'RNA a doppio filamento del gene bersaglio, noto come RNAi alimentazione 16,17. Genoma biblioteche alimentazione RNAi interi sono stati generati per il genoma di screening RNAi 16,18. Qui, una Salmonella infezione proprotocollo è accoppiato con RNAi alimentazione per consentire la sperimentazione C. elegans geni di interesse per la loro capacità di proteggere contro l'infezione da Salmonella.
Protocol
Representative Results
Discussion
C. elegans è un organismo semplice modello genetico che mangia i batteri come fonte di nutrienti. Così, è facile da sostituire la alimentare batterica normale con un patogeno intestinale per indagare le interazioni tra C. elegans e l'agente patogeno scelto. Qui un protocollo è descritto combinare Salmonella infezione e C. elegans RNAi alimentazione trattamento per esaminare il ruolo dei geni ospitanti in difesa contro le infezioni da Salmonella. Protocolli di preceden…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo il Dott. Diane Baronas-Lowell per la lettura critica del manoscritto. Questo lavoro è stato supportato da un FAU Charles E. Schmidt College of Science Seed Grant e una borsa di studio invecchiamento della Ellison Medical Foundation di KJ
Materials
| LB Broth | Fisher | BP9723-500 | |
| XLD agar | EMD Chemicals | 1.05287.0500 | |
| Bacto Agar | Fisher | DF0140-01-0 | |
| Peptone | Fisher | BP1420-500 | |
| Sodium Chloride | Fisher | S671-500 | |
| Calcium Chloride | Fisher | C69-500 | |
| Magnesium Sulfate | Fisher | M65-500 | |
| IPTG | Gold Biotechnology | 12481C50 | |
| Cholesterol | Sigma | C8667-25G | |
| Ampicillin | Fisher | BP1760-25 | |
| Salmonella typhimurium | ATCC | ATCC14028 | |
| Petri Dish 95 x 15mm | Fisher | FB0875714G | |
| Petri Dish 60 x 15mm | Fisher | 08-757-13A | |
| Falcon Serological pipet | Fisher | 13-668-2 | |
| Falcon Express Pipet-Aid | Fisher | 13-675-42 | |
| MaxQ6000 shaking incubator | Thermo Scientific | SHKE6000-7 | |
| Incubator | Percival | I-36DL |
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