An approach is presented for determining structures of viral membrane glycoprotein complexes using a combination of electron cryo-tomography and sub-tomogram averaging with the computational package Jsubtomo.
Kappeklædte vira udnytter membranglycoproteiner på deres overflade for at mægle indrejse i værtsceller. Tre-dimensionel strukturel analyse af disse glycoprotein 'pigge' ofte er teknisk udfordrende, men vigtig for forståelsen af viral patogenese og i udviklingen af lægemidler. Her er en protokol præsenteres for viral spike struktur beslutsomhed gennem beregningsmæssige gennemsnit af elektron kryo-tomografi data. Electron cryo-tomografi er en teknik i elektronmikroskopi anvendes til at udlede tredimensionale tomografiske volumen rekonstruktioner eller tomogrammer, af pleomorfe biologiske prøver såsom membran virus i en nær-indfødt, frosne hydreret tilstand. Disse tomogrammer afsløre strukturer af interesse i tre dimensioner, men ved lav opløsning. Computational gennemsnitsberegning af sub-mængder, eller sub-tomogrammer, er nødvendig for at opnå højere opløsning detalje gentage strukturelle motiver, såsom virale glycoprotein spikes. En detaljeret beregningsmæssige tilgang til Aligning og gennemsnit sub-tomogrammer hjælp af Jsubtomo softwarepakken er skitseret. Denne fremgangsmåde muliggør visualisering af strukturen af virale glycoprotein pigge til en opløsning i området 20-40 Å og undersøgelse af studiet af højere ordens spike-til-spids interaktioner på virion membran. Typiske resultater er præsenteret for Bunyamwera virus, en kappevirus fra familien Bunyaviridae. Denne familie er en strukturelt forskelligartet gruppe af patogener udgør en trussel for menneskers og dyrs sundhed.
Electron cryo-tomografi er en elektron kryo-mikroskopi billeddannelse teknik tillader beregningen af en tredimensional (3D) genopbygning af komplekse biologiske prøver. Egnede prøver spænder fra oprensede makromolekylære komplekser 1, filamenter 2, coatede vesikler 3 og pleomorfe membran vira 4 til hele prokaryote celler 5 og endda tynde områder af hele eukaryote celler 6. Efter indsamling af data af en tilt-serie, 3D tomografiske mængder, eller tomogrammer, kan beregnes ved hjælp af flere etablerede softwarepakker, herunder Bsoft 7 og israelske forsvarsminister 8.
To aspekter, der er forbundet med studiet af biologiske prøver ved elektronmikroskopi kryo-tomografi grænse biologiske fortolkning af de tilsvarende tomografiske mængder. Først på grund af den begrænsede elektron dosis, der kan anvendes til biologiske materialer, før indførelse af betydelig skade stråling signal-til-støj-forhold i tomografiske data er typisk meget lav. For det andet, som et resultat af begrænset prøve tilt geometri under dataindsamlingen, nogle visninger af objektet forbliver fraværende, hvilket fører til en såkaldt "manglende kile 'artefakt i tomografisk volumen. Imidlertid kan begge disse begrænsninger kan overvindes, hvis tomografiske volumen indeholder gentage identiske strukturer, såsom makromolekylære komplekser, der kan være held midlede 9-12.
Før gennemsnit strukturer fra tomogram rekonstruktioner, skal genstande af interesse findes og afstemt med samme orientering. Lokalisering af sådanne strukturer kan opnås ved krydskorrelation af en skabelon struktur i tomografiske volumen ved hjælp af en fremgangsmåde, der ofte omtales som template matching 13. Den skabelon, der anvendes i dette matchende proces kan udledes elektron kryo-mikroskopi eller elektronmikroskopi kryo-tomografi kombineret med 3D-rekonstruktion, eller det kan være en densitet kort simuleret fraen atomare struktur. Adskillige beregningsmæssige pakker er blevet udviklet til at udføre disse opgaver 11.
Midling glycoproteinkomponenter pigge af membran vira, såsom HIV-1, har været en særdeles vellykket strategi for at studere deres struktur 14-16. En forståelse af strukturen er integreret for at afsløre både det molekylære grundlag for virus-værts interaktioner og vejlede antivirale og vaccine design udvikling. Mens makromolekylære krystallografi er den teknik valg for høj opløsning (normalt bedre end 4 Å) strukturel analyse af individuelle virale glycoproteiner og deres komplekser, X-ray strukturer af denne metode af proteiner isoleret fra naturlige membranøs miljø virionet . Således vigtige detaljer såsom højere orden arkitektur af virale glycoproteiner, i forbindelse med virionet fortsat mangler. På den anden side, elektronstråler kryo-mikroskopi og enkelt partikel genopbygningaf hele kappeklædte vira er begrænset til virioner med tyvefladet symmetri 17,18. Electron cryotomography kombineret med sub-volumen justering har således vist sig som en supplerende teknik tillader studiet af glycoprotein pigge af uregelmæssigt formede, pleomorfe vira in situ.
Vi har udviklet software opkaldt Jsubtomo (www.opic.ox.ac.uk/jsubtomo) til påvisning, justering og gennemsnitsberegning af tomografiske sub-mængder. Jsubtomo er blevet anvendt i strukturen bestemmelse af en række cellulære og virale strukturer 19-26. Her skitserer vi en detaljeret protokol, som gør det muligt bestemmelsen viral-overflade spike strukturer. For at omgå overdreven forfinelse af midlede strukturer ved at korrelere støj, er den "gyldne standard 'raffinement, der er vedtaget 10,27. Endelig strategier til visualisering og fortolkning af typiske resultater diskuteres.
Kendskab til viral glycoprotein spike struktur på virion membranen er væsentlige for forståelsen af virusreplikation og udvikling af lægemidler til at behandle og forebygge infektion. Electron cryo-mikroskopi kombineret med enkelt partikel gennemsnitsberegning er blevet den mest anvendte metode til at løse de strukturer omsluttede viruspartikler, herunder glycoprotein pigge. Imidlertid er denne fremgangsmåde begrænset til icosahedrally symmetriske virus. Her ved anvendelse af elektron kryo-tomografi og subtomogram gennemsnitsberegning i Jsubtomo, har vi skitseret en generel protokol til bestemmelse af glycoprotein pigge på pleomorfe indkapslede vira, der ikke er modtagelige for andre aktuelle strukturelle biologi metoder. Vores repræsentative resultater viser, at løsningen af denne metode er tilstrækkelig til at afsløre indsigt i domæne arkitektur, oligomerisering og højere orden organisering af glycoprotein pigge på intakte virioner.
jove_content "> Det mest kritiske skridt i denne protokol er ved at opføre to pålidelige udgangspunkter modeller, der er statistisk uafhængige af hinanden. vellykket gennemførelse af dette trin forudsætter, at glycoprotein spikes er tilstrækkeligt stort og ikke pakket mod hinanden for stramt, så de enkelte pigge kan genkendes visuelt og manuelt plukkes i tomogrammer, og to uafhængige modeller gennemsnit. Hvis dette ikke er muligt, to ændringer til protokol kan forsøges. Først to uafhængige stokastiske modeller kan konstrueres ved først at definere to tilfældige delmængder af subtomograms og derefter gennemsnittet af subtomograms inden for disse delmængder 30. andet, hvis en struktur af den isolerede spike er afledt af andre midler, for eksempel ved røntgenkrystallografi, kan den anvendes som et udgangspunkt model. Dog skal der drages omsorg for lavt indhold pass filter denne model med en lav opløsning cut-off (50-70 Å), da de to resulterende modeller i den næste runde af raffinement vilvære statistisk uafhængig kun ud over denne beslutning. På grund af denne advarsel, anbefales det tidligere tilgang.Den opnåelige opløsning fra denne protokol afhænger af fire vigtige faktorer: i. dataindsamling strategi og kvaliteten af input-data, ii. antal subtomograms iii. tilpasning nøjagtighed subtomograms, og iv. heterogenitet af strukturerne. Mens den første og anden begrænsning i vid udstrækning kan overvindes ved hjælp af højt signal-til-støj direkte elektron detektorer kombineret med CTF korrigerede tomografi og automatiserede dataindsamling er tilpasningen nøjagtighed påvirket yderligere af størrelsen og formen af strukturen af interesse selv. Ved anvendelse af denne protokol på små pigge mangler fremtrædende træk, kan det være fordelagtigt at binde Fab fragmenter til spyddet til at forbedre tilpasningen nøjagtighed og dermed opløsning 31. Endelig, hvis de strukturer, som middelværdier udviser flere konformationer, sub-tomogram klassifikation metoder kan anvendes til gennemsnittet forskellige konformationer separat. Med henblik herpå Jsubtomo integreres med Dynamo pakke, der tilbyder kraftfuld subtomogram klassificering 9.
Ovennævnte protokol er komplementær til røntgenkrystallografi af isolerede virale glycoproteiner. Krystallografiske strukturer kan monteres i sub-tomogram gennemsnit for at opnå den nøjagtige orientering af glycoproteinet med hensyn til virion-membran. Anvendelse af denne metode vil uden tvivl fortsætte med at kaste lys på kappeklædte virus struktur og Patobiologi.
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by the Academy of Finland (130750 and 218080 to J.T.H.), the Wellcome Trust (090532/Z/09/Z; 089026/Z/09/Z to T.A.B.), and by the MRC (MR/J007897/1 to J.T.H and T.A.B; MR/L009528/1 to T.A.B.).
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Jsubtomo (ver 1.3.1) | University of Oxford | n/a | www.opic.ac.uk/jsubtomo |
Bsoft (ver 1.8.7) | NIAMS, NIH | n/a | bsoft.ws |
UCSF Chimera | UCSF | n/a | www.cgl.ucsf.edu/chimera |