संरचना फोकस: एक सेल आधारित परख एक जीन की oncogenic क्षमता का निर्धारण करने के लिए
Summary
फोकस गठन परख एक उम्मीदवार ओंकोजीन के बदलने क्षमता का आकलन करने के लिए एक सरल तरीका प्रदान करता है।
Abstract
Malignant transformation of cells is typically associated with increased proliferation, loss of contact inhibition, acquisition of anchorage-independent growth potential, and the ability to form tumors in experimental animals1. In NIH 3T3 cells, the Ras signal transduction pathway is known to trigger many of these events, what is known as Ras transformation. The introduction of an overexpressed gene in NIH 3T3 cells may promote morphological transformation and loss of contact inhibition, which can help determine the oncogenic potential of that gene of interest. An assay that provides a straightforward method to assess one aspect of the transforming potential of an oncogene is the Focus Formation Assay (FFA)2. When NIH 3T3 cells divide normally in culture, they do so until they reach a confluent monolayer. However, in the presence of an overexpressed oncogene, these cells can begin to grow in dense, multilayered foci1 that can be visualized and quantified by crystal violet or Hema 3 staining. In this article we describe the FFA protocol with retroviral transduction of the gene of interest into NIH 3T3 cells, and how to quantify the number of foci through staining. Retroviral transduction offers a more efficient method of gene delivery than transfection, and the use of an ecotropic murine retrovirus provides a biosafety control when working with potential human oncogenes.
Introduction
ट्यूमर कोशिकाओं में जीन अभिव्यक्ति के पैटर्न से रूपात्मक और proliferative परिवर्तन करने के लिए epigenomics करने के लिए, परिवर्तन की एक विस्तृत श्रृंखला से अपने सामान्य समकक्षों से प्रतिष्ठित किया जा सकता है। बाद में, अंत में, जानवरों में इंजेक्शन जब ट्यूमर फार्म की क्षमता घातक परिवर्तन 3 की उपयोगी, औसत दर्जे का संकेतक हैं, सीरम पर निर्भरता, संपर्क (घनत्व) निषेध की हानि, लंगर स्वतंत्र प्रसार के अधिग्रहण के लिए कम और। इन विट्रो में और vivo assays में कई सेलुलर परिवर्तन के लिए विकसित किया गया है। इन विट्रो assays उद्देश्य (कम सीरम में वृद्धि) की पहचान करने और संस्कृति आकृति विज्ञान (फोकस गठन परख), संस्कृति गतिशीलता (विकास दर, संतृप्ति घनत्व) और विकास का पहलू में परिवर्तन को मापने में या आवश्यकताओं लंगर (नरम अगर में वृद्धि)। एक सेल प्रकार का घातक प्रकृति का निर्धारण करने के लिए स्वर्ण मानक प्रायोगिक पशुओं में ट्यूमर गठन (xenografts) बनी हुई है। हालांकि, टीवह लागत और vivo अध्ययन की लंबाई हमेशा उम्मीदवार ओंकोजीन की पहली सत्यापन कदम या स्क्रीनिंग के रूप में उन्हें न्यायोचित नहीं बनाते हैं। कोई इन विट्रो परख एक जीन के oncogenic क्षमता का एक निश्चित आकलन प्रदान करता है, वे vivo अध्ययन में भविष्य के नीचे संकीर्ण हो सकता है कि oncogenic क्षमता में अंतर्दृष्टि प्रदान करते हैं। इन विट्रो में oncogenic संभावित मूल्यांकन के लिए सबसे व्यापक रूप से इस्तेमाल किया प्रणालियों में से एक फोकस गठन परख 2 है। यह दृष्टिकोण एनआईएच 3T3 माउस तंतुप्रसू, मजबूत संपर्क निषेध से पता चलता है कि एक गैर तब्दील सेल लाइन के उपयोग पर निर्भर करता है। घनत्व पर निर्भर विकास के नुकसान में एक ओंकोजीन परिणामों की overexpression; बदल कोशिकाओं तो आसानी से गैर-बदल कोशिकाओं की पृष्ठभूमि monolayer के खिलाफ कल्पना "foci", बनाने, कई परतों में विकसित कर सकते हैं। संपर्क inhib के नुकसान के सबूत के रूप फोकस गठन परख, तो, घातक परिवर्तन के लिए प्रेरित करने के लिए एक उम्मीदवार ओंकोजीन की क्षमता के उपायएक औसत दर्जे का phenotype के रूप में ition। एफएफए (जैसे, एसआरसी 4, BRAF 5) प्रोटीन kinases की overexpression, प्रतिलेखन कारक (उदाहरण के लिए, एन-MYC 6) (जैसे, P2RY8 7), जी-प्रोटीन-युग्मित रिसेप्टर्स और GTPases (जैसे द्वारा परिवर्तन का मूल्यांकन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है , रास 1), दूसरों के बीच में। इस परख के रिश्तेदार आसानी यह जीन की overexpression इन विट्रो में एनआईएच 3T3 माउस fibroblast कोशिकाओं को बदलने के लिए पर्याप्त है कि क्या करने के लिए एक त्वरित और नेत्रहीन स्पष्ट जवाब प्रदान करेगा कि एक अच्छा विकल्प बनाती है।
इस प्रोटोकॉल में वर्णित एफएफए वायरल पैकेजिंग प्रोटीन प्रदान करता है जो बेनी-ई पैकेजिंग सेल लाइन 8, का उपयोग करता है, और रेट्रोवायरल वेक्टर pBABEpuro 9 (Addgene प्लाज्मिड 1764) रेट्रोवायरस निर्माण करने के लिए। ब्याज की जीन से युक्त pBABEpuro निर्माण के साथ अभिकर्मक के बाद, बेनी-ई सेल लाइन एनआईएच 3T3 कोशिकाओं को संक्रमित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि ecotropic रेट्रोवायरस का उत्पादन होगा। टीजीन डिलीवरी के अपने वायरल विधि पारंपरिक रासायनिक अभिकर्मक तरीकों की तुलना में अधिक कुशल है और यह स्थायी जीन 10 व्यक्त करने के लिए एक तरीका प्रदान करता है। एक बार एनआईएच 3T3 कोशिकाओं के जीनोम में शामिल किया है, ब्याज की जीन की overexpression वायरल लंबे टर्मिनल दोहराता (लीटर) प्रमोटर 11 से प्रेरित है। यह लगातार अभिव्यक्ति एनआईएच 3T3 कोशिकाओं पर foci के गठन, द्वारा मापा के रूप में ब्याज की जीन, oncogenic गतिविधि है कि क्या यह निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
एफएफए इन विट्रो में घातक परिवर्तन का मूल्यांकन करने के लिए एक त्वरित और आसान तरीका प्रदान करता है। यह उम्मीदवार जीन की एक अपेक्षाकृत बड़ी संख्या की स्क्रीनिंग के लिए उत्तरदायी है, और उसके मामूली त?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम एनआईएच निदेशक नई अन्वेषक पुरस्कार कार्यक्रम (ईडी) से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया। ए.ए. राष्ट्रीय कैंसर संस्थान और राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन से स्नातक पुरस्कार द्वारा समर्थित किया गया था।
Materials
| pBABE-puro vector | Addgene | Plasmid 1764 | cloning vector |
| Platinum-E Retroviral Packaging Cell Line, Ecotropic | Cell Biolabs, Inc. | RV-101 | cell line for viral production |
| NIH 3T3 Cell Line murine | Sigma-Aldrich | 93061524 | cell line for focus formation assay |
| 10 mL BD Luer-Lok tip syringe | BD Biosciences | 309604 | viral production reagent |
| 0.45 μm Puradisc Syringe Filter | Whatman | 6750-2504 | viral production reagent |
| Polyethylenimine (PEI) | Polysciences, Inc. | 23966-2 | cell transfection reagent |
| Polybrene Infection / Transfection Reagent | EMD Millipore | TR-1003-G | cell transfection reagent |
| Crystal Violet | Fisher Scientific | C581-25 | cell stain reagent |
| Plasmid Plus Midi Kit | QIAGEN | 12945 | plasmid purification |
| BD Falcon Tissue Culture Dishes | BD Biosciences | 353003 | cell culture supplies |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 11995-065 | cell culture media |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Gibco | 25300-054 | cell culture supplies |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Gibco | 31985-062 | cell culture media |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 16000-044 | cell culture media |
References
- Clark, G. J., Cox, A. D., Graham, S. M., Der, C. J. Biological assays for Ras transformation. Methods in enzymology. , 255-395 (1995).
- Celis, J. E. . Cell biology : a laboratory handbook. , 345-352 (2006).
- Raptis, L., Vultur, A. Neoplastic transformation assays. Methods in molecular biology. 165, 151-164 (2001).
- Johnson, P. J., Coussens, P. M., Danko, A. V., Shalloway, D. Overexpressed pp60c-src can induce focus formation without complete transformation of NIH 3T3 cells. Molecular and cellular biology. 5, 1073-1083 (1985).
- Bonner, T. I., Kerby, S. B., Sutrave, P., Gunnell, M. A., Mark, G., Rapp, U. R. Structure and biological activity of human homologs of the raf/mil oncogene. IMolecular and cellular biology. 5, 71400-71407 (1985).
- Yancopoulos, G. D., et al. N-myc can cooperate with ras to transform normal cells in culture. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 82, 5455-5459 (1985).
- Fujiwara, S., et al. Transforming activity of purinergic receptor P2Y, G protein coupled, 8 revealed by retroviral expression screening. Leukemia & lymphoma. 48, 978-986 (2007).
- Morita, S., Kojima, T., Kitamura, T. Plat-E: an efficient and stable system for transient packaging of retroviruses. Gene. 7, 1063-1066 (2000).
- Morgenstern, J. P., Land, H. Advanced mammalian gene transfer: high titre retroviral vectors with multiple drug selection markers and a complementary helper-free packaging cell line. Nucleic acids research. 18, 3587-3596 (1990).
- Kim, T. K., Eberwine, J. H. Mammalian cell transfection: the present and the future. Analytical and bioanalytical chemistry. 397, 3173-3178 (2010).
- Klaver, B., Berkhout, B. Comparison of 5′ and 3′ long terminal repeat promoter function in human immunodeficiency virus. Journal of virology. 68, 3830-3840 (1994).
- Fukumoto, Y., et al. Cost-effective gene transfection by DNA compaction at pH 4.0 using acidified, long shelf-life polyethylenimine. Cytotechnology. 62, 73-82 (2010).
- Fox, E. J., Wright, S. C. S-phase-specific expression of the Mad3 gene in proliferating and differentiating cells. The Biochemical journal. 359, 361-367 (2001).
- Yun, J. S., Rust, J. M., Ishimaru, T., Diaz, E. A novel role of the Mad family member Mad3 in cerebellar granule neuron precursor proliferation. Molecular and cellular biology. 27, 8178-8189 (2007).
- Gore, Y., Lantner, F., Hart, G., Shachar, I. Mad3 negatively regulates B cell differentiation in the spleen by inducing Id2 expression. Molecular biology of the cell. 21, 1864-1871 (2010).
- Barisone, G. A., Yun, J. S., Diaz, E. From cerebellar proliferation to tumorigenesis: new insights into the role of Mad3. Cell cycle. 7, 423-427 (2008).
- Barisone, G. A., et al. Role of MXD3 in proliferation of DAOY human medulloblastoma cells. PloS One. 7, e38508 (2012).
- Nair, S. K., Burley, S. K. X-ray structures of Myc-Max and Mad-Max recognizing DNA. Molecular bases of regulation by proto-oncogenic transcription factors. Cell. 112, 193-205 (2003).
