인간 아데노바이러스의 스파이크를 사용하여 소량의 물 샘플에 대한 최적의 바이러스 농도 조건을 식별하기 위한 접근 방식이 개발되었습니다. 여기에 설명된 기법은 다른 바이러스 표적에 대한 농도 매개변수를 식별하는 데 사용되며 대규모 바이러스 농도 실험에 적용됩니다.
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이 논문에서
요약
초록
바이러스의 소규모 농도(시료 부피 1-10L, 여기서는 스파이크 100ml 물 시료로 시뮬레이션)는 바이러스 농도에 대한 최적의 매개변수를 식별하는 효율적이고 비용 효율적인 방법입니다. 바이러스는 여과(전기 양성, 전기 음성, 유리솜 또는 크기 배제)를 사용하여 물에서 농축된 다음 쇠고기 추출물로 2차 농축하여 필터 표면에서 바이러스를 방출하고 마지막으로 3차 농축하여 5-30ml 부피의 바이러스 농축물을 생성할 수 있습니다. 최적의 농도 절차를 확인하기 위해 두 가지 다른 전기 양성 필터(유리/셀룰로오스 필터[1MDS] 및 나노 알루미나/유리 필터[NanoCeram])와 서로 다른 2차 농도 기술을 평가했습니다. 세 가지 다른 셀라이트 입자 크기(미세, 중간 및 대)를 평가한 후 이 기술을 확립된 유기 응집 방법과 비교하는 Celite 기술. 또한 다양한 용출 첨가제가 필터 표면에서 아데노바이러스(AdV) 입자의 방출을 향상시키는 능력에 대해 평가되었습니다. 미립자 셀라이트는 2차 농축 중에 바이러스 스파이크가 추가되었을 때 확립된 유기 응집 방법과 유사한 수준의 AdV40 및 41을 회복했습니다. 유리/셀룰로오스 필터는 나노 알루미나/유리 섬유 필터에 비해 AdV40 및 41 모두에서 더 높은 수치를 회수했습니다. 통계적으로 유의하지는 않지만, 0.1% 폴리인산나트륨 수정 쇠고기 추출물 용리액을 첨가하면 수정되지 않은 쇠고기 추출물에 비해 AdV 입자가 10% 더 많이 회수되었습니다.
서론
인간의 장내 바이러스는 수 인성 질병에 1-3의 중요한 원인이 요원하지만, 농도없이 자신의 검출이 어려워 일반적으로 오염 된 환경 바다에서 낮은 숫자에 존재한다. 바이러스를 농축하는데 사용 된 절차는 일반적으로 필터 용출액 여과 필터 뒤에 용출 단계, 및 보조 농도를 포함한다. 일반적인 여과 절차 (최근 4,5 검토) 등 전기 양성 필터와 같은 충전 세포막의 사용에 의존한다. 이 필터는 필터 표면 (양전하)과 대상 바이러스 입자 사이의 정전 기적 상호 작용을 사용하여 물에 현탁 바이러스를 캡처에 의존 (음전하). 시판되는 두 전성 필터가이 기술에 의존하는, 유리 / 셀룰로오스 나노 알루미나 / 유리 섬유 필터. 유리 / 셀룰로오스 필터 비용이 유리 (/ CE)의 사용을 제한하는 최대 10 배 나노 알루미나 / 유리 섬유의, 아르일상 바이러스 모니터링을위한 llulose 필터. 최근 연구에 싼 필터 대안의 사용을 정당화 차이가 주변 물 6,7에서 엔테로 바이러스의 회복이 두 필터 사이의 공칭 결론을 내렸다. 이러한 전성 유리 양모 필터와 같은 다른 필터 옵션 그러나, 그들은 하나의 소스 물 (전기 음성 필터)의 전처리가 필요하거나 (유리 양모 필터) 상업적으로 사용할 수 없습니다, 연구되고있다. 바이러스 농도 절차의 개발은 주로 물에....
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프로토콜
유리 및 필터 하우징 1. 준비
- 특별히 언급하지 않는 한, 15 분 동안 121 ° C에서 모든 유리, 필터 하우징 및 솔루션을 소독. 불임을 보장하기 위해 모든 개구 또는 알루미늄 호일 또는 이전 살균에 테이프 확보 종이 중 하나에 노출 된 표면을 커버합니다.
- 1 L 사이드 암 삼각 플라스크에 필터 하우징 (47mm 직경)를 부착하여 여과 장치를 조립합니다. 필요한 필터를 수집 : 47mm 직경 전기 음성 / 전기 양성 디스크 필터를.
- 1 L의 1.5 %의 쇠고기 추출물 준비 (응집을 플록 입자를 생성 용액의 pH를 3.5, 또는 비 응집 저하되면, pH를 3.5에서 골재를하지 않는) 비프 엑기스 15g에 용해시켜, 0.05 M 글리신, 1 탈 이온수의 L과 3.75 g 글리신을 추가.
주 : 비 응집 쇠고기 추출물 전에 급 농도 셀 라이트의 첨가를 필요로 할 것이다. - 용출 첨가제 나트륨 polyph 추가0.1 % 농도에서 쇠고기 추출물 osphate.
- 1 M 염산 용액을 첨가 쇠고기 추출물, 원하는 산도로 pH를 혼합 용액에 적가 하였다. 121 ℃에서 15 ~ 30 분간 오토 클레이브 쇠고기 추출물.
- 잘, 매체, 또는....
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결과
셀 라이트 선택
셀 라이트의 세 가지 다른 종류의 이전 실적이 가장 좋은 변종의 선택을 시험 하였다. 중간 크기의 입자를 미세과 Celites 가장 높은 아데노 바이러스 복구를 생산했다. 큰 celites의 사용은 AdV40 41 (범위 32 % -100 %) (그림 1) 모두 회수율 결과. 아데노 바이러스 (40)의 평균 회수율은 1백44퍼센트 ± 52 % (미세), 115 % ± 28 % (중간) 및 82 % ± 53 % (대형) 입자 celites 있었다 AdV41, 1백32% ± 39 % (미세), 83 % ±에 대한 25 % (중) 11 % (대형) ± 50 %. 일방향 ANOVA는 최적화 된 셀 라이트 기술은 각각 19 % 및 109퍼센트 ± 16 %, ± 75 %를 회수 유기 응집 방법의 것과 AdV40 (P = 0.7920) 및 41 (P = 0.1439)의 통계적으로 유사한 수준을 회복 .......
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토론
전기 양성 필터는 물에서 바이러스를 집중에 유용하다; 그러나 이러한 필터는 다시 자신의 효과를 변경할 수있는 그들의 구조와 구성이 다를 수 있습니다. 이 문제를 복잡하게, 캡시드 구조와 요금 농도 기술은 최적의 복구 (15)을 보장하기 위해 맞출 필요 바이러스 균주에 따라서 다릅니다. (예를 들어, 전기 양성 필터, 쇠고기 추출물 용출), 대상 바이러스의보다 효과적인 농도 (16, 17)을 달성 할 수있는 기존의 농도의 단순한 변형 기법 스루.
지금까지 연구는 일반적으로 기본 농도 (필터) 단계를 수정하여 바이러스의 회복에 초점을 맞추고있다,하지만 약간의주의는 바이러스 복구 (18)에 영향을 줄 수있는 후속 농도 절차에 주어졌다. 이것은 다른 기법 이차 농도 바이러스 회수율 6,13,19,20 영향을 미칠 수 있음을 입증되었다. CELI빠르고 간단한 시료 처리 절차를 사용하는 동안 .......
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공개 사항
경쟁하는 금전적 이해관계가 없습니다.
이 기사에 표현된 견해는 저자의 견해이며 반드시 미국 환경 보호국의 견해나 정책을 반영하는 것은 아닙니다. 상표명 또는 상업용 제품에 대한 언급은 사용에 대한 보증 또는 권장을 구성하지 않습니다.
감사의 글
원고를 검토해 주신 Nicholas J. Ashbolt 박사와 G. Shay Fout 박사에게 감사드립니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 아데노바이러스 40 주식 | ATCC | VR-931 | |
| 아데노바이러스 41 주식 | ATCC | VR-930 | |
| 티오황산나트륨 | Fluka Chemical Co. | 72051 | |
| Celites #577 | 플루카 케미컬 | 22142 | |
| NanoCeram 47mm | 아르고나이드 | N/A | |
| 1MDS 47mm | 3M | 6408502 | |
| AP-20 프리필터 47mm | Millipore Corp. | ||
| 글리신 | Sigma | 50046-1KG | |
| 폴리인산나트륨 | 아크로스 유기물 | 390930010 | |
| 트립신 | Gibco | 25200 | |
| PBS | 시그마 | P5368 | |
| 염산 | 피셔 | A481-212 | |
| BBL 쇠고기 추출물 | BD Biosciences | 212303 | |
| Difco 쇠고기 추출물 | BD Biosciences | 211520 | |
| ABI 7900 Real-time PCR 시스템 | ABI | N/A | |
| 스테인리스강 필터 하우징 | Millipore Corp. | ||
| 혈액 DNA 추출 키트 | Qiagen | 51104 | |
| EPA MPN 계산기 | http://www.epa.gov/nerlcwww/online.html |
참고문헌
- Sinclair, R. G., Jones, E. L., Gerba, C. P. Viruses in recreational water-borne disease outbreaks: a review. Journal of Applied Microbiology. 107, 1769-1780 (2009).
- WHO. Guidelines for Safe Recreational Water Environments. , World Health Organization. Geneva. (2003).
- Westrell, T., et al.
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재인쇄 및 허가
