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Immunology and Infection

के सम्पुटी सीरोवर्गनिर्धारण Published: September 25, 2014 doi: 10.3791/51747
Automatic Translation
1, 1, 1,2
1Pneumococcal Research, Murdoch Childrens Research Institute, 2Department of Microbiology and Immunology, Peter Doherty Institute for Infection and Immunity, The University of Melbourne

Summary

लेटेक्स समूहन परीक्षण स्ट्रैपटोकोकस निमोनिया सीरोवर्गनिर्धारण के लिए एक सरल, तेजी से और सस्ता तरीका है, और भी व्यापक रूप से नैदानिक ​​सूक्ष्म जीव विज्ञान में लागू किया गया है. यह पांडुलिपि लेटेक्स समूहन अभिकर्मकों, गुणवत्ता नियंत्रण प्रक्रियाओं के घर में उत्पादन और न्यूमोकोकल सीरोवर्गनिर्धारण करने के लिए इस तकनीक के आवेदन का वर्णन करता है.

Introduction

स्ट्रैपटोकोकस निमोनिया (pneumococcus) पांच साल से कम आयु के बच्चों में रुग्णता और मृत्यु दर का एक प्रमुख कारण है पुरानी दुनिया चौड़ा विशेष रूप से संसाधन गरीब सेटिंग्स 1,2 में,. ऐसे निमोनिया, पूति के रूप में जीवन धमकी स्थितियों के लिए स्थानीय संक्रमण से न्यूमोकोकल रोग पर्वतमाला और 1,2 मैनिंजाइटिस.

Pneumococci से अधिक 90 सीरमप्रकारों पहचान उनके सम्पुटी polysaccharide 3 में अंतर के आधार पर किया गया है. वर्तमान टीके सम्पुटी polysaccharide लक्ष्य और आक्रामक रोग 4 के कारण प्रमुख सीरमप्रकारों से सुरक्षा प्रदान करते हैं. न्यूमोकोकल आइसोलेट्स सीरोवर्गनिर्धारण गाड़ी और रोग पर टीकाकरण के प्रभाव का आकलन करने के साथ ही व्यापक महामारी जानकारी 5,6 प्रदान करने के लिए महत्वपूर्ण है. न्यूमोकोकल सीरोवर्गनिर्धारण के लिए वर्तमान 'सोने के मानक' विधि Quellung परीक्षण है, लेकिन यह समय लगता है और perfo के लिए कुछ कौशल की आवश्यकताआरएम 7. लेटेक्स समूहन विश्व स्वास्थ्य संगठन 7 से सिफारिश की एक वैकल्पिक सीरोवर्गनिर्धारण विधि है. लेटेक्स समूहन प्रदर्शन करने के लिए त्वरित और सरल है, और दुनिया भर में 8-11 कई प्रयोगशालाओं में कार्यरत है. महत्वपूर्ण बात है, लेटेक्स समूहन न्यूमोकोकल सीरोवर्गनिर्धारण 10,12-14 के लिए Quellung परीक्षण करने के लिए तुलनीय सटीकता दिखाया गया है. कुल मिलाकर, इस विधि संसाधन गरीब सेटिंग्स के साथ ही उच्च throughput प्रयोगशालाओं के लिए आदर्श है.

लेटेक्स समूहन अभिकर्मकों ('लेटेक्स अभिकर्मकों') लेटेक्स कणों से 15 एंटीबॉडी की कुर्की द्वारा बनाई गई हैं. एक सकारात्मक प्रतिक्रिया में, इन लेबल कणों विशिष्ट प्रतिजन की उपस्थिति में सरेस से जोड़ा हुआ. वाणिज्यिक लेटेक्स अभिकर्मकों सीरमप्रकारों की एक सीमित रेंज के लिए उपलब्ध हैं. लेटेक्स अभिकर्मकों भी व्यावसायिक रूप से उपलब्ध antisera 10 का उपयोग करते हुए घर में तैयार किया जा सकता है. Antisera के मिश्रण ('ताल') के साथ ही न्यूमोकोकल है के लिए विशिष्ट antiseraerogroups (जैसे, समूह 19), व्यक्तिगत सीरमप्रकारों (जैसे, सीरोटाइप 5), और विशिष्ट एंटीजन को ('कारकों', जैसे., सीरोटाइप 19A पहचानने कारक 19C) आगे समूहों के भीतर सीरमप्रकारों परिभाषित करने के लिए 16 उपलब्ध हैं.

यह पांडुलिपि लेटेक्स कणों को व्यावसायिक रूप से उपलब्ध antisera के निष्क्रिय लगाव का उपयोग लेटेक्स अभिकर्मकों के उत्पादन में प्रमुख कदम की रूपरेखा. इस विधि की गुणवत्ता नियंत्रण (QC) के पहलुओं का वर्णन किया जाता है, और न्यूमोकोकल सीरोवर्गनिर्धारण के लिए लेटेक्स अभिकर्मकों के उपयोग के लिए एक प्रोटोकॉल शामिल है.

Protocol

घर में कंडोम अभिकर्मकों की 1. तैयारी

  1. ग्लाइसिन बफर खारा की तैयारी (जीबीएस)
    1. 1.5 ग्राम ग्लाइसिन, 11.7 ग्राम सोडियम क्लोराइड और एक 200 मिलीलीटर कांच बीकर आसुत पानी की 100 मिलीलीटर जोड़ें.
    2. एक चुंबकीय उत्तेजक का उपयोग भंग करने मिलाएं.
    3. सिलेंडर को मापने के लिए एक 500 मिलीलीटर मिश्रण स्थानांतरण और 200 मिलीलीटर की एक कुल बनाने के लिए आसुत जल जोड़ें.
    4. , 200 मिलीलीटर बीकर को वापस समाधान स्थानांतरण पीएच की जांच और 5 एम सोडियम हाइड्रोक्साइड के साथ 8.2 करने के लिए समायोजित. नोट: सोडियम हाइड्रोक्साइड संक्षारक है, व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण पहनने.
    5. फ़िल्टर एक 250 मिलीलीटर preautoclaved पेंच छाया हुआ कांच की बोतल में 0.22 माइक्रोन फिल्टर और कई 60 मिलीलीटर सीरिंज का उपयोग कर समाधान बाँझ.
    6. आरटी पर स्टोर.
  2. 0.2% गोजातीय सीरम albumin साथ जीबीएस की तैयारी
    1. एक 200 मिलीलीटर कांच बीकर गोजातीय सीरम albumin (बीएसए) पाउडर की 0.2 ग्राम और जीबीएस की 100 मिलीलीटर जोड़ें और एक चुंबकीय उत्तेजक का उपयोग भंग करने के लिए मिश्रण.
    2. फ़िल्टरएक 250 मिलीलीटर preautoclaved पेंच छाया हुआ कांच की बोतल में कई 60 मिलीलीटर सीरिंज का उपयोग कर 0.22 माइक्रोन फिल्टर के माध्यम से समाधान बाँझ.
    3. 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर.
  3. लेटेक्स अभिकर्मक तैयारी
    1. नीचे microfuge ट्यूब दौर एक 2 मिलीलीटर लेबल.
      नोट: दौर नीचे ट्यूब एंटीबॉडी लगाव को प्रभावित कर सकता है, जो कण निपटाने के लिए कम से कम करने के लिए उपयोग किया जाता है.
    2. बाँझ सुझावों microfuge ट्यूब में जीबीएस के 975 μl जोड़ने के साथ एक P1000 विंदुक का प्रयोग, तो लेटेक्स अभिकर्मक (यानी, पूल, समूह, प्रकार या कारक) तैयार किया जा रहा है के लिए उपयुक्त न्यूमोकोकल सीरमरोधी के 25 μl जोड़ें. मिश्रण करने के लिए पांच बार पलटना.
    3. बाँझ शारीरिक खारा के 1,080 μl को लेटेक्स कणों के 120 μl जोड़कर polystyrene लेटेक्स कणों 01:10 पतला.
      नोट: यह बड़ी मात्रा में बनाया जा सकता है, लेकिन लेटेक्स अभिकर्मकों उत्पादित कर रहे हैं ताजा हर बार किया जाना चाहिए.
    4. 1 (कदम 1.3.3 में तैयार) 1:10 लेटेक्स निलंबन की 1,000 μl जोड़ें,000 μl 01:40 सीरमरोधी निलंबन (चरण 1.3.2 में तैयार). मिश्रण करने के लिए पांच बार पलटना.
    5. एक धीरे घूर्णन पहिया पर 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं (उदाहरण के लिए, 38.5 सेमी व्यास का एक पहिया के लिए 4 आरपीएम) 2 घंटे के लिए.
    6. 1100 x जी पर 15 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र. सतह पर तैरनेवाला त्यागें और धीरे बाँझ खारा के 2 मिलीलीटर में गोली resuspend.
    7. 1100 x जी पर 15 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र. सतह पर तैरनेवाला त्यागें और जीबीएस के 1 मिलीलीटर जोड़ने और धीरे गोली resuspend.
    8. एक लेबल 5 मिलीलीटर में लेटेक्स निलंबन पिपेट ट्यूब छाया हुआ पेंच. जीबीएस का एक और 1 मिलीलीटर जोड़ें.
    9. जीबीएस (पीएच 8.2) (1.2 चरण में तैयार) (w / v) 0.2% बीएसए युक्त के 2 मिलीलीटर जोड़ें. 10% एक संरक्षक के रूप में सोडियम azide की (w / v) समाधान के 40 μl जोड़ें.
      नोट: सोडियम azide साँस अगर खतरनाक है, और एक त्वचा और आंख अड़चन है. इस साँस लेना जोखिम के जोखिम को कम करता है, क्योंकि यह पाउडर के रूप के बजाय एक तैयार 10% समाधान खरीद करने के लिए वांछनीय है. दस्ताने सहित व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण (इस अभिकर्मक से निपटने जब डी छप चश्में) पहना जाना चाहिए. जानकारी के लिए सामग्री सुरक्षा डाटा शीट को देखें.
    10. 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर लेटेक्स अभिकर्मकों.
  4. नकारात्मक नियंत्रण लेटेक्स अभिकर्मक की तैयारी
    1. नीचे microfuge ट्यूब दौर एक 2 मिलीलीटर लेबल.
      नोट: दौर नीचे ट्यूब एंटीबॉडी लगाव को प्रभावित कर सकता है, जो कण निपटाने के लिए कम से कम करने के लिए उपयोग किया जाता है.
    2. बाँझ सुझावों microfuge ट्यूब में जीबीएस के 975 μl जोड़ने के साथ एक P1000 विंदुक का प्रयोग, तो 25 μl सामान्य खरगोश सीरमरोधी जोड़ें. मिश्रण करने के लिए पांच बार पलटना.
    3. चरणों में आगे बढ़ने के रूप ऊपर 1.3.10 को 1.3.3

2 गुणवत्ता नियंत्रण लेटेक्स अभिकर्मकों की (क्यूसी)

  1. आरटी को लेटेक्स अभिकर्मक लाओ. तुरंत उपयोग करने से पहले, धीरे ट्यूब कई बार inverting द्वारा लेटेक्स अभिकर्मक मिश्रण.
  2. एक गिलास खुर्दबीन स्लाइड पर 15 μl pipetting द्वारा autoagglutination के लिए अभिकर्मक की जाँच करें और कदम 4.7 और नीचे 4.8 में के रूप में आगे बढ़ना. कोई एक होना चाहिएलेटेक्स कणों की gglutination. अभिकर्मक सफेद और चिकनी प्रकट करना चाहिए.
  3. कम बीतने न्यूमोकोकल वियोजन के एक पैनल के खिलाफ अभिकर्मक का परीक्षण करें. आइसोलेट्स के पैनल 'लक्ष्य' सीरोटाइप की वियोजन (अभिकर्मक के लिए विशिष्ट सीरोटाइप परीक्षण किया जा रहा है) और 'गैर लक्ष्य' सीरमप्रकारों (सामान्य रूप से पार नहीं करना चाहिए कि अन्य सीरमप्रकारों के वियोजन को शामिल करना चाहिए चरण 3 में तैयार के रूप में हौसले हो गई संस्कृतियों का उपयोग ) अभिकर्मक के साथ प्रतिक्रिया. क्यूसी के दौर से गुजर प्रत्येक लेटेक्स अभिकर्मक के लिए प्रत्येक लक्ष्य और गैर लक्ष्य सीरोटाइप की कम से कम एक अलग शामिल करें. विशेष सीरोटाइप की केवल एक ही लक्ष्य या गैर लक्ष्य सीरोटाइप, परीक्षण दो अलग वियोजन अगर वहाँ.
    नोट: परीक्षण पैनल इनवेसिव रोग और / या प्रकार संस्कृति संग्रह में असामान्य हैं, जिनमें से कुछ प्रत्येक सीरोटाइप के कई वियोजन, शामिल होना चाहिए. वे अक्सर (नहीं दिखाया डेटा) सीरोटाइप के लिए और अधिक की मांग कर रहे हैं के रूप में यह इस प्रकार आगे क्षमता ओ परीक्षण, कुछ गाड़ी आइसोलेट्स शामिल करने के लिए बेहतर हैअभिकर्मकों च और अभिकर्मकों आक्रामक और गाड़ी आइसोलेट्स दोनों सीरोवर्गनिर्धारण की संभावना सक्षम हैं सुनिश्चित करना है कि.
  4. लक्ष्य और गैर लक्ष्य न्यूमोकोकल साथ लेटेक्स अभिकर्मकों के परीक्षण के साथ आगे बढ़ें चरण 3 और नीचे 4 में वर्णित विधि के अनुसार आइसोलेट्स.
  5. कम से कम सालाना उसके बाद तो उत्पादन का समय और पर गुणवत्ता नियंत्रण अभिकर्मकों.
    नोट: एक अभिकर्मक QC पारित नहीं होता है, तो बैच त्याग और एक नई तैयारी बनाया जाना चाहिए. दोहराने क्यूसी विफलता की स्थिति में हम अभिकर्मकों Ortika एट अल., 2013 8 में और नीचे चर्चा में वर्णित वैकल्पिक तरीकों का उपयोग कर उत्पादन किया जा सलाह देते हैं.

सीरोवर्गनिर्धारण के लिए न्यूमोकोकल संस्कृति के 3 तैयारी

  1. एक बाँझ पाश का उपयोग न्यूमोकोकल की एक कॉलोनी का चयन प्राथमिक inoculum थाली सतह से लगभग एक तिहाई को शामिल किया गया है, ताकि एक ठोस nonselective रक्त अगर पर इस बाहर अलग और लकीर. एकल कालोनियों के लिए स्ट्रीक.
    नोट: Defibrinated घोड़ा या भेड़ रक्त से तैयार प्लेट्स उपयुक्त हैं; लेकिन मानव रक्त या citrated पशु रक्त के साथ तैयार रक्त प्लेटों नहीं कर रहे हैं.
  2. 5% सीओ 2 के माहौल में 37 डिग्री सेल्सियस पर थाली ओ / एन सेते हैं.
  3. शुद्धता के लिए थाली पर विकास को ध्यान से देखें और सीरोवर्गनिर्धारण के लिए पर्याप्त वृद्धि है कि वहाँ का आकलन करें.
    नोट: न्यूमोकोकल अलग का एक शुद्ध संस्कृति सीरोवर्गनिर्धारण के लिए आवश्यक है. थाली सतह से लगभग एक तिहाई को कवर हमारे अनुभव, मिला हुआ, या मिला हुआ पास विकास में आमतौर पर सीरोवर्गनिर्धारण पूरा करने के लिए पर्याप्त है. न्यूमोकोकल संस्कृतियों autolysis होने का खतरा हो सकता है, सीरोवर्गनिर्धारण के लिए तैयार संस्कृतियों उपसंस्कृति के 24 घंटे के भीतर जांच की जानी चाहिए. सीरोवर्गनिर्धारण शुरू होने से पहले अधिक से अधिक 15 से 20 मिनट के लिए इनक्यूबेटर से बाहर संस्कृति प्लेट न लें.

4 आयोजन लेटेक्स समूहन सीरोवर्गनिर्धारण

  1. लगभग लिए आरटी को गर्म करने के लिए उन्हें फ्रिज में से सभी लेटेक्स अभिकर्मकों निकालें और अनुमति30 मिनट imately. तुरंत उपयोग करने से पहले, धीरे अभिकर्मकों मिश्रण करने के लिए ट्यूब पलटना.
  2. एक खुर्दबीन स्लाइड लेबल.
  3. खुर्दबीन स्लाइड पर नकारात्मक नियंत्रण लेटेक्स अभिकर्मक के 15 μl रखें.
  4. पाश लगभग आधा भरा हुआ है कि इतनी एक बाँझ डिस्पोजेबल 1 μl पाश का उपयोग न्यूमोकोकल संस्कृति का एक झाड़ू ले.
  5. धीरे नकारात्मक नियंत्रण लेटेक्स अभिकर्मक की बूंद के करीब स्लाइड की सतह पर inoculum धब्बा. inoculum गिलास स्लाइड पर दिखाई जानी चाहिए.
  6. जल्दी और अच्छी तरह पाश का उपयोग नकारात्मक नियंत्रण लेटेक्स अभिकर्मक में inoculum मिश्रण. बूंद अपनी प्रारंभिक आकार से आगे फैल नहीं है कि सुनिश्चित करें.
  7. दोनों सिरों पर पकड़े, स्लाइड उठाओ. आगे पीछे 1 मिनट के लिए स्लाइड रॉक. धीरे धीरे आगे बढ़ तरल रखना, और बूंद के आकार में वृद्धि नहीं है यह सुनिश्चित करने के लिए ध्यान रखना.
    नोट: वैकल्पिक रूप से एक थाली घुमाव का उपयोग करें.
  8. स्थूल समूहन (यानी, द्वारा लिए निरीक्षणनग्न आंखों) और एक काले रंग की पृष्ठभूमि के खिलाफ निलंबन के समाशोधन.
  9. नकारात्मक नियंत्रण लेटेक्स अभिकर्मक कोई समूहन से पता चलता है या समाशोधन कदम ऊपर 4.1-4.8 में नकारात्मक नियंत्रण लेटेक्स अभिकर्मक के लिए परीक्षण लेटेक्स अभिकर्मकों की जगह, संस्कृति परीक्षण जारी हैं. एक ताजा पाश हर बार इस्तेमाल किया जाना चाहिए. पूल के साथ शुरू लेटेक्स अभिकर्मकों के परीक्षण के साथ आगे बढ़ें.
  10. एक सकारात्मक परीक्षण प्राप्त किया जाता है जब तक उत्तराधिकार में 'पूल' लेटेक्स अभिकर्मकों के प्रत्येक परीक्षा.
    नोट:. जैसे, पहली स्लाइड पर तीन सबसे अधिक संभावना पूल के लिए परीक्षण द्वारा विशेष सीरमप्रकारों (स्थानीय घटनाओं को प्रतिबिंबित करने के लिए 'राउंड' में किया जा सकता है पूल के परीक्षण का आदेश एक सकारात्मक प्रतिक्रिया प्राप्त नहीं है, तो परीक्षण ) और इतने पर सकारात्मक प्रतिक्रिया प्राप्त होने तक, अगले तीन दूसरी स्लाइड पर शेष पूल की सबसे अधिक संभावना है. यह सबसे आम सीरमप्रकारों आवश्यक समय और अभिकर्मकों कम से कम पहले परीक्षण कर रहे हैं कि यह सुनिश्चित करता है.
  11. Antisera निर्माता की कुंजी का प्रयोग सकारात्मक पूल में प्रतिनिधित्व कर रहे व्यक्ति जो antisera निर्धारित करते हैं.
  12. कदम ऊपर 4.1-4.8 में के रूप में 'समूह' या 'प्रकार' निर्धारित करने के लिए व्यक्तिगत रूप से सकारात्मक पूल में निहित समूहों या प्रकार की प्रत्येक परीक्षा.
  13. Antisera निर्माता की कुंजी करने के लिए संदर्भ से परिणाम का निर्धारण करते हैं. एक 'प्रकार' निर्धारित किया जाता है (उदाहरण के लिए, सीरोटाइप 5), तो आगे परीक्षण की जरूरत है और इस परिणाम दर्ज की गई है.
  14. एक 'समूह' निर्धारित किया जाता है (उदाहरण के लिए, समूह 19), फिर परीक्षण किया जा कारकों का निर्धारण करने के लिए निर्माताओं कुंजी को देखें. व्यक्तिगत 'फैक्टर' लेटेक्स अभिकर्मकों के साथ जांच जारी रखने और अंतिम सीरोटाइप (जैसे, सीरोटाइप 19B) का निर्धारण.

Representative Results

लेटेक्स कण से जुड़ी प्रकार विशिष्ट एंटीबॉडी pneumococcus के कैप्सूल को बांधता है, और एंटीबॉडी लेबल कणों का समूहन 15 ensues जब एक सकारात्मक लेटेक्स प्रतिक्रिया होती है. चित्रा 1 ए पृष्ठभूमि के दृश्य समूहन और समाशोधन के द्वारा होती है जो एक सकारात्मक प्रतिक्रिया से पता चलता है निलंबन. एक नकारात्मक प्रतिक्रिया चिकनी और सफेद (चित्रा 1 बी) शेष लेटेक्स समूहन अभिकर्मक निलंबन की विशेषता है. एक सकारात्मक प्रतिक्रिया एक मिनट का समय अंतराल (लगभग 20 सेकंड में आमतौर पर detectable) के अंत से पहले मनाया जाना चाहिए कि इतनी अभिकर्मकों अनुकूलित कर रहे हैं. हम 1 मिनट समय अंतराल के बाद प्रतिक्रियाओं को पढ़ने की सिफारिश नहीं है. बहुत कभी कभी, प्रतिक्रियाओं पृष्ठभूमि निलंबन के समाशोधन के साथ, या कोई पृष्ठभूमि समाशोधन के साथ 'रेशेदार' प्रकट नहीं होता है कि बूंद के किनारे के आसपास कमजोर समूहन प्रदर्शन (नहीं दिखाया डेटा). इन सबसे अधिक हैं जैसे ly नकारात्मक प्रतिक्रियाओं. ऐसे मामलों में, हम retesting और / या किसी अन्य सीरोवर्गनिर्धारण विधि (उदाहरण के लिए Quellung प्रतिक्रिया 17) का उपयोग करते हुए आगे की जांच की सिफारिश.

चित्रा 1
चित्रा 1 सकारात्मक और नकारात्मक लेटेक्स समूहन प्रतिक्रियाओं. एक न्यूमोकोकल की तैयारी के लिए एक सकारात्मक प्रतिक्रिया (ए) या ​​एक नकारात्मक प्रतिक्रिया (बी) दिखा लेटेक्स समूहन अभिकर्मक के साथ मिश्रित अलग. पृष्ठभूमि के समाशोधन के साथ समूहन इसमें नकारात्मक नियंत्रण लेटेक्स अभिकर्मक के साथ या एक नकारात्मक परीक्षण की प्रतिक्रिया (बी) में नहीं दिखाई समूहन है सकारात्मक प्रतिक्रिया (ए) में देखा जाता है. फोटो 8 अनुमति के साथ इस्तेमाल किया."लक्ष्य =" _blank "> इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Discussion

लेटेक्स समूहन न्यूमोकोकल सीरोवर्गनिर्धारण के लिए एक सरल, त्वरित और सस्ता तरीका है. वाणिज्यिक न्यूमोकोकल लेटेक्स समूहन अभिकर्मकों उपलब्ध हैं, लेकिन वे वर्तमान में सभी ज्ञात न्यूमोकोकल 10,12 सीरमप्रकारों अंतर नहीं है. हालांकि, लेटेक्स समूहन अभिकर्मकों आसानी से विशिष्ट न्यूमोकोकल सम्पुटी एंटीजन के खिलाफ उठाया खरीदा antisera का उपयोग घर में उत्पादन किया जा सकता है. यहाँ वर्णित विधि में, एंटीबॉडी निष्क्रिय लेटेक्स समूहन अभिकर्मकों का एक सेट बनाने के लिए लेटेक्स कणों से जुड़े होते हैं.

न्यूमोकोकल की polysaccharide कैप्सूल 18,19 अलग पर लेटेक्स कणों के लिए बाध्य विशिष्ट एंटीबॉडी एंटीजन को देते हैं जब एक सकारात्मक लेटेक्स प्रतिक्रिया होती है. एंटीबॉडी से जुड़ी लेटेक्स कणों विशिष्ट एंटीबॉडी प्रतिजन प्रतिक्रिया बढ़ाई बिना देखे जा करने की अनुमति.

लेटेक्स समूहन उच्च throughput प्रयोगशालाओं एक के लिए एक उपयुक्त तरीका हैसंसाधन गरीब सेटिंग्स के लिए भी होगी. लेटेक्स समूहन विधि का मुख्य लाभ कोई विशेष उपकरणों का परीक्षण करने के लिए आवश्यक है कि कर रहे हैं, अभिकर्मकों 4 डिग्री सेल्सियस 8 पर संग्रहीत जब कम से कम 2 साल की एक शैल्फ जीवन है, और यह सस्ती, सरल और जल्दी है कि प्रदर्शन करने के लिए. लेटेक्स समूहन द्वारा एक न्यूमोकोकल अलग सीरोवर्गनिर्धारण लगभग 10 मिनट लगते हैं, और ऊपर से चार लेटेक्स अभिकर्मकों एक स्लाइड पर समानांतर में परीक्षण किया जा सकता है. सीरमप्रकारों की व्यापकता प्रासंगिक महामारी विज्ञान सेटिंग के लिए जाना जाता है इसके अलावा, अगर, परीक्षण Quellung परीक्षण 17 को इसी प्रकार सबसे आम सीरमप्रकारों युक्त पूल के साथ शुरू राउंड में प्रदर्शन किया जा सकता है. यह दृष्टिकोण सीरोटाइप निर्धारित करने की जरूरत परीक्षणों की संख्या कम करता है. विधि भी अलग ऑपरेटरों के बीच अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य है (नहीं दिखाया डेटा). लेटेक्स समूहन सीरोवर्गनिर्धारण का एक नुकसान अभिकर्मकों उत्पादन लगभग 4 घंटा ले रही है, समय लगता है कि है; कई Reage हालांकिएनटीएस आसानी से समानांतर में उत्पादन किया जा सकता है. इसके अलावा, कुछ एंटीजन कुछ antisera के साथ पार प्रतिक्रियाओं में जिसके परिणामस्वरूप विभिन्न न्यूमोकोकल सीरमप्रकारों भर में आम हैं (उदाहरण के लिए, सीरोटाइप 29, 42 और समूह 35). (आमतौर पर अधिक समस्याग्रस्त पार प्रतिक्रिया एंटीबॉडी को दूर करने के preabsorbed जाता है) वाणिज्यिक antisera और अतिरिक्त प्रतिक्रिया तालिकाओं का उपयोग मौजूद है जो सीरोटाइप भेद करने के क्रम में निर्माता द्वारा प्रदान की जाती हैं फिर भी, जब इन पार प्रतिक्रियाओं अच्छी तरह से विशेषता है. एंटीबॉडी लेटेक्स कणों पर ठीक से नहीं जुड़ रहे हैं तो भी पार कर सकते हैं लेटेक्स अभिकर्मकों प्रतिक्रिया; इन क्यूसी विफलताओं के रूप में पहचान कर रहे हैं. हमारे अनुभव में, कठोर QC व्यावसायिक रूप से उपलब्ध antisera उत्पादन के लिए उपयोग किया जाता है, तब भी जब इस विधि की सफलता के लिए केंद्रीय है. क्यूसी अभिकर्मक के अनुसार लगभग 15 मिनट लगते हैं और ऊपर वर्णित आइसोलेट्स के रूप में उपयुक्त क्यूसी का एक सेट पर निर्भर करता है.

यहाँ वर्णित विधि एक सकारात्मक प्रतिक्रिया अच्छी तरह से वाई दे कि अभिकर्मकों में परिणामपरीक्षण अवधि पतली. हमारे अनुभव में, झूठी सकारात्मक (नहीं दिखाया डेटा) अभ्यास में दुर्लभ हैं. समसामयिक झूठी नकारात्मक प्रतिक्रियाओं मनाया जाता है; आमतौर पर इन एक विशेष सीरमरोधी साथ ज्ञात समस्याओं (जैसे, सेरोग्रुप 6 वियोजन पूल बी सीरमरोधी के साथ प्रतिक्रिया नहीं कर सकते हैं), या अलग से कैप्सूल अभिव्यक्ति के नीचे विनियमन से संबंधित हैं. एक झूठी सकारात्मक या नकारात्मक प्रतिक्रिया एक 'अंधा' अंत परिणाम प्राप्त होंगे ज्यादातर मामलों में के रूप में निर्माता द्वारा प्रदान सीरोवर्गनिर्धारण algrorithm का उपयोग करना, यह भी महत्वपूर्ण है. प्रतिक्रियाओं की व्याख्या करना मुश्किल है जब इन मामलों में, और हम इस तरह के Quellung प्रतिक्रिया के रूप में एक वैकल्पिक विधि से दोहराने परीक्षण और / या जांच की सिफारिश.

कुछ समस्या निवारण कभी कभी संतोषजनक लेटेक्स अभिकर्मकों बनाने के लिए आवश्यक है. यहाँ वर्णित विधि में, एंटीबॉडी निष्क्रिय सोखना 15,19 के माध्यम से लेटेक्स कणों से जुड़ा हुआ है, इसलिए एक महत्वपूर्ण चर कैसे अच्छी तरह से निर्धारित करता है जो इस्तेमाल किया एंटीबॉडी की एकाग्रता है,लेटेक्स कणों की सतह को कवर किया और एंटीबॉडी सक्रिय साइटों 15,20 के बाद संरेखण है. अपर्याप्त या अतिरिक्त एंटीबॉडी लेटेक्स कणों से जुड़ा हुआ है नतीजतन, अगर, एंटीबॉडी प्रतिजन प्रतिक्रियाओं इष्टतम नहीं होगा, और असंतोषजनक अभिकर्मकों 15,20,21 उत्पादन किया जा सकता है. एंटीबॉडी titers antisera के विभिन्न बहुत सारे के बीच अलग अलग रूप में, dilutions की एक मानक सेट में अच्छी तरह से 8 प्रदर्शन कि अभिकर्मकों उत्पादन नहीं हो सकता है. एक उपयोगी प्रारंभ बिंदु सीरमरोधी का एक 1:40 कमजोर पड़ने का उपयोग करने के लिए है, और यह सफल नहीं है, तो आगे सीरमरोधी पतला. हमारे अनुभव में यह आम तौर पर समस्या 8 निराकरण करता है. मामलों की एक छोटी संख्या में अभिकर्मकों लक्ष्य आइसोलेट्स के साथ परीक्षण किया जब निलंबन के समाशोधन के साथ नहीं है कि कमजोर समूहन दिखा सकते हैं. अभिकर्मक की गुणवत्ता में सुधार नहीं करता है, लेकिन संतोषजनक अभिकर्मकों आमतौर पर centrifugation omitting द्वारा उत्पादित किया जा सकता है और धोने 8,22 कदम सीरमरोधी गिराए इन मामलों में

एंटीबॉडी लेपित लेटेक्स कणों कई विभिन्न रोगाणुओं 15,20 का पता लगाने, पहचान या सीरोवर्गनिर्धारण के लिए नैदानिक ​​सूक्ष्म जीव विज्ञान में आमतौर पर इस्तेमाल कर रहे हैं. जैसे, यहाँ वर्णित विधि अन्य प्रयोजनों के लिए लेटेक्स अभिकर्मकों की तैयारी के लिए उपयुक्त हो सकता है, बशर्ते उपयुक्त antisera उपलब्ध है और पर्याप्त QC प्रक्रिया को अपनाया जाता है.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Microparticles based on polystyrene, 800 nm Sigma 65984-10 ml-F Or other volumes as required
Normal rabbit serum Antibodies Australia  NRS-1ml Or other volumes as required, bring to RT before use
Pneumococcus (Neufeld) antisera SSI Diagnostica Various Bring to RT before use
http://www.ssi.dk/ssidiagnostica
Sterile Bovine Albumin  Sigma A-4503 Bring to rRT before use
Sodium azide 10% (v/v) solution  VWR International ROAC3902/100ml Caution: hazardous if inhaled; skin and eye irritant
Eppendorf Safe-Lock tubes, 2 ml Eppendorf 0030 120.094 Round bottom
Sodium chloride Merck 10241.AP
Calibrated disposable inoculating loops 1 µl Copan CD175SO1
Glass microscope slides 76 mm x 26 mm Thermo Fisher Scientific LBS 2950RC
5 M NaOH BDH 10252 Caution: highly corrosive
Glycine Merck 10119.05
Horse Blood Agar (HBA) plates Thermo Fisher Scientific PP2001 Bring to RT before use
http://www.thermofisher.com.au
Rotating wheel Wyble Engineering Development Corporation
Polystyrene flat bottom screw cap tube, 5 ml Technoplas S5016SU
60 ml syringes without needles Terumo SS-60L
Millex-GP syringe filter unit, 0.22 µm Merck Millipore SLGP033RS
Brochure on Neufeld antisera Statens Serum Institut Key to determining serotypes
http://www.ssi.dk/ssidiagnostica
Key to pneumococcal factor serum Statens Serum Institut 18058 For determining serotype within Groups
http://www.ssi.dk/ssidiagnostica
*alternative sources are available for most materials

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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इम्यूनोलॉजी अंक 91 antisera pneumococci polysaccharide कैप्सूल स्लाइड समूहन
के सम्पुटी सीरोवर्गनिर्धारण<em&gt; स्ट्रैपटोकोकस निमोनिया</em&gt; लेटेक्स समूहन द्वारा
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Porter, B. D., Ortika, B. D., Satzke, C. Capsular Serotyping of Streptococcus pneumoniae by Latex Agglutination. J. Vis. Exp. (91), e51747, doi:10.3791/51747 (2014).

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