Summary
Teste de aglutinação em látex é um método simples, rápido e barato para sorotipagem Streptococcus pneumoniae, e também tem sido amplamente aplicada em microbiologia de diagnóstico. Este manuscrito descreve a produção in-house de reagentes de aglutinação de látex, procedimentos de controle de qualidade e da aplicação desta técnica de sorotipagem pneumocócica.
Introduction
Streptococcus pneumoniae (pneumococo) é uma das principais causas de morbidade e mortalidade em crianças menores de cinco anos de idade, particularmente em locais com poucos recursos de 1,2 em todo o mundo. Gamas de doença pneumocócica de infecções localizadas a condições de risco de vida, tais como pneumonia, sepse e meningite 1,2.
Mais de 90 sorotipos de pneumococos foram identificados com base em diferenças na sua polissacarídeo capsular 3. As vacinas atuais direcionar o polissacarídeo capsular e fornecer proteção contra os principais sorotipos causadores de doença invasiva 4. Sorotipagem pneumocócica isolamentos é importante para avaliar o impacto da vacinação sobre a carruagem e doença, bem como proporcionar informações epidemiológicas mais amplo 5,6. O actual método "padrão ouro" para sorotipagem pneumocócica é o teste Quellung, mas é demorado e requer alguma habilidade para perform 7. Aglutinação em látex é um método de sorotipagem alternativa recomendada pela Organização Mundial da Saúde 7. Aglutinação em látex é rápido e simples de realizar, e é empregada em muitos laboratórios em todo o mundo 8-11. Importante, aglutinação em látex mostrou precisão comparável ao teste Quellung para sorotipagem pneumocócica 10,12-14. No geral, este método é ideal para locais com poucos recursos, bem como laboratórios de alto rendimento.
Os reagentes de aglutinação de látex ('reagentes de látex') são criados por meio da ligação de anticorpos a partículas de látex 15. Numa reacção positiva, estas partículas marcadas aglutinar na presença do antigénio específico. Reagentes de látex comerciais estão disponíveis para uma gama restrita de sorotipos. Reagentes de látex também pode ser preparada em casa usando anti-soros comercialmente disponível 10. Misturas de anti-soro ("pools"), bem como os anti-soros específicos para s pneumocócicaserogroups (por exemplo, grupo 19), os serotipos individuais (por exemplo, o serotipo 5), e a antigénios específicos ("factores", por exemplo., factor de 19c reconhecimento do serotipo 19A) para a definição mais serotipos dentro grupos estão disponíveis 16.
Este manuscrito descreve os principais passos na produção de reagentes de látex utilizando ligação passiva de anti-soros disponíveis comercialmente a partículas de látex. O controlo de qualidade (QC) os aspectos deste método encontram-se descritos, e um protocolo para o uso de reagentes de látex para serotipagem pneumocócica está incluído.
Protocol
1 Preparação de in-house Reagentes látex
- Preparação de solução salina tamponada com glicina (GBS)
- Adicionar 1,5 g de glicina, cloreto de sódio e 11,7 g de 100 ml de água destilada para uma proveta de vidro de 200 ml.
- Misturar até dissolver-se utilizando um agitador magnético.
- Transferir a mistura de 500 ml de medição de cilindro e adicionando água destilada, para perfazer um total de 200 ml.
- Transferir a solução de volta para o copo de 200 ml, verificar o pH e ajustar para 8,2 com hidróxido de sódio 5 M. NOTA: O hidróxido de sódio é corrosivo, usar equipamento de protecção pessoal.
- Filtrar esterilizar a solução com 0,22 mm e vários filtros de 60 ml seringas em um frasco de vidro com tampa de rosca ml preautoclaved 250.
- Armazenar à temperatura ambiente.
- Preparação de GBS com 0,2% de albumina de soro bovino
- Adicionar 0,2 g de albumina de soro bovino (BSA) em pó e 100 ml de GBS para uma proveta de vidro de 200 ml e misturar até se dissolver utilizando um agitador magnético.
- Filtraresterilizar a solução através de filtros de 0,22 mM utilizando várias seringas de 60 ml em um ml preautoclaved parafuso frasco de vidro tampado 250.
- Armazenar a 4 ° C.
- Preparação de reagentes Latex
- Rotular a 2 ml redondas microtubo de fundo.
NOTA: rodada tubos de fundo são usados para minimizar partícula acerto o que pode afetar ligação de anticorpos. - Usando uma pipeta P1000 com pontas estéreis adicionar 975 ul de GBS no tubo de microcentrífuga, em seguida, adicionar 25 ul de anti-soro pneumocócica adequado ao reagente de látex a ser preparado (por exemplo, associação, grupo, o tipo ou o factor). Inverta cinco vezes para misturar.
- Dilui-se partículas de látex de poliestireno 01:10 por adição de 120 ul de partículas de látex de 1,080 pi de solução salina fisiológica estéril.
NOTA: Este pode ser feito em grandes volumes, mas deve ser feito fresco cada vez que os reagentes de látex são produzidas. - Adicionar 1000 mL da suspensão de látex 1:10 (preparado no passo 1.3.3) para o 1,000 ul de suspensão 1:40 de anti-soro (preparado no passo 1.3.2). Inverta cinco vezes para misturar.
- Incubar a 37 ° C sobre uma roda de rotação lenta (por exemplo, 4 rpm para uma roda de 38,5 cm de diâmetro), durante 2 horas.
- Centrifugar durante 15 minutos a 1100 x g. Descartar o sobrenadante e ressuspender cuidadosamente o sedimento em 2 ml de solução salina estéril.
- Centrifugar durante 15 minutos a 1100 x g. Descartar o sobrenadante e adicionar 1 ml de GBS e delicadamente ressuspender o sedimento.
- Pipetar a suspensão de látex em um rotulados 5 ml com tampa de rosca de tubo. Adicione mais 1 ml de GBS.
- Adicionar 2 ml de GBS contendo 0,2% de BSA (w / v) (pH 8,2) (preparada no passo 1.2). Adicionar 40 ul de 10% (w / v) de solução de azida de sódio como conservante.
NOTA: A azida sódica é perigoso se inalado, e é uma pele e dos olhos irritante. É desejável para adquirir uma solução preparada a 10% em vez do que a forma em pó, como o que minimiza o risco de exposição por inalação. Equipamento de proteção individual (incluindo luvas umóculos d respingo) deve ser usado quando manusear este reagente. Consulte a Ficha de Segurança para obter detalhes. - Reagentes de látex armazenar a 4 ° C.
- Rotular a 2 ml redondas microtubo de fundo.
- Preparação do reagente de látex controlo negativo
- Rotular a 2 ml redondas microtubo de fundo.
NOTA: rodada tubos de fundo são usados para minimizar partícula acerto o que pode afetar ligação de anticorpos. - Usando uma pipeta P1000 com pontas estéreis adicionar 975 ul de GBS no tubo de microcentrífuga, em seguida, adicionar 25 ul de anti-soro de coelho normal. Inverta cinco vezes para misturar.
- Proceda como nos passos 1.3.3 a 1.3.10 acima
- Rotular a 2 ml redondas microtubo de fundo.
2 Controle de Qualidade (CQ) de látex Reagentes
- Traga reagente de látex para TR. Imediatamente antes da utilização, mistura suavemente o reagente de látex, invertendo o tubo várias vezes.
- Verifique reagente para autoaglutinação pipetando 15 mL em uma lâmina de vidro e proceda como nos passos 4.7 e 4.8 abaixo. Não deve haver umgglutination das partículas de látex. O reagente deve aparecer branca e lisa.
- Teste o reagente contra um painel de baixa passagem isolados de pneumococo. Use culturas recém-cultivadas preparados como no passo 3 O painel de isolados deve incluir isolados do sorotipo 'target' (o sorotipo específico para o reagente a ser testada) e sorotipos "não-alvo" (isolados de outros sorotipos que não deve normalmente cruzam reagem com o reagente). Inclua pelo menos um isolado de cada alvo e não-alvo para cada sorotipo reagente látex passando por QC. Se houver apenas um alvo ou sorotipo não-alvo, teste de duas amostras diferentes do sorotipo particular.
NOTA: O painel de teste deve incluir vários isolados de cada sorotipo, alguns dos quais são comuns na doença invasiva e / ou coleções de culturas de tipo. É preferível incluir uma carruagem isolados, uma vez que são muitas vezes mais exigente para o serótipo (dados não mostrados), assim, ainda mais a testar o Capacidadef os reagentes e garantir que os reagentes são provavelmente capazes de sorotipagem tanto invasivo e transporte isola. - Proceder com testes de reagentes de látex com alvo e pneumocócica não-alvo isolados de acordo com o método descrito nas etapas 3 e 4 abaixo.
- Reagentes de controle de qualidade no momento da produção e, em seguida, pelo menos, anualmente.
NOTA: Se um reagente não passa QC, o lote deve ser descartada e uma nova preparação feita. Em caso de falha de repetição QC recomendamos os reagentes ser produzidos utilizando os métodos alternativos descritos no Ortika et al. De 2013 8 e na discussão que se segue.
3 Preparação das Culturas pneumocócicas para sorotipagem
- Usando uma agulha esterilizada selecionar uma única colônia da pneumocócica e isolar este raia-se para um meio de ágar de sangue não selectivo sólida de modo que o inoculo primário cobre aproximadamente um terço da superfície da chapa. Streak para colónias isoladas.
NOTA: As lâminas preparadas a partir de cavalo desfibrinado ou sangue de carneiro são adequados; mas as placas de sangue preparadas com sangue ou sangue de animais com citrato não são. - Incubar a placa S / N a 37 ° C numa atmosfera de 5% de CO 2.
- Observar o crescimento na placa para avaliar a pureza e que há um crescimento suficiente para serotipagem.
Observação: Uma cultura pura do isolado de pneumococos é necessário para serotipagem. Na nossa experiência, confluentes, ou perto de crescimento confluente abrangendo aproximadamente um terço da superfície da placa é geralmente suficiente para completar a serotipagem. Como as culturas pneumocócicas podem ser propenso a autólise, culturas preparadas para sorotipagem deve ser testada dentro de 24 horas de subcultura. Não tome a placa de cultura de fora da incubadora mais do que 15 a 20 minutos antes da sorotipagem começa.
4 Realização de sorotipagem de aglutinação em látex
- Remova todos os reagentes de látex de geladeira e deixe-os a aquecer a temperatura ambiente por aproximadamentemadamente 30 min. Imediatamente antes da utilização, inverter cuidadosamente os tubos para misturar os reagentes.
- Rotular uma lâmina de microscópio.
- Coloque 15 mL de reagente de látex controle negativo sobre a lâmina de microscópio.
- Usando um circuito descartável 1 ml estéril tomar uma varredura da cultura pneumocócica para que o ciclo é de aproximadamente meio cheio.
- Suavemente manchar o inoculo sobre a superfície da lâmina próximo da gota de reagente de látex de controlo negativo. O inóculo deve ser visível sobre a lâmina de vidro.
- Depressa e bem misturar o inóculo para o reagente de látex de controle negativo usando o loop. Certifique-se de que a queda não se espalhou mais longe do que seu tamanho inicial.
- Pegue o slide, segurando-o em ambas as extremidades. Balance a deslizar para trás e para frente para 1 min. Ter o cuidado de manter o líquido em movimento, lentamente, e assegurar que o tamanho da gota não aumenta.
NOTA: Como alternativa, use uma placa oscilante. - Observe a aglutinação macroscópica (ou seja, porolho nu) e compensação da suspensão contra um fundo preto.
- Se o reagente de látex de controlo negativo não mostra nenhuma aglutinação ou de compensação continua testando a cultura, substituindo os reagentes de teste de látex para o reagente de látex de controlo negativo em passos 4,1-4,8 acima. Um laço fresco deve ser usado de cada vez. Prossiga com o teste dos reagentes de látex começando com as piscinas.
- Teste cada um dos reagentes de látex 'pool' em sucessão, até que um teste positivo é obtido.
NOTA:. A ordem dos testes das piscinas podem ser feitas em 'rounds' para refletir a incidência local dos sorotipos específicos (por exemplo, por meio de testes para as três piscinas mais prováveis sobre o primeiro slide Se uma reação positiva não é obtido, em seguida, teste a próxima mais provável três das piscinas restantes na segunda corrediça, e assim por diante até que uma reacção positiva é obtido). Isto assegura que os serotipos mais comuns são testados em primeiro lugar, minimizando o tempo e os reagentes necessários. - Usando a chave do fabricante do anti-soro anti-soros individuais determinar quais são representados no conjunto positivo.
- Teste cada um dos grupos ou tipos contidos na piscina positiva individualmente para determinar o 'grupo' ou 'tipo' como nos passos 4,1-4,8 acima.
- Determinar o resultado por referência a chave do fabricante do anti-soro. Se um 'tipo' é determinado (por exemplo, o sorotipo 5), então não há mais testes são necessários e este resultado é gravado.
- Se um 'grupo' é determinado (por exemplo, grupo 19), em seguida, referem-se à chave fabricantes para determinar os fatores a serem testados. Continuar os testes com os reagentes de látex "fator" individuais e determinar o sorotipo final (por exemplo, 19B sorotipo).
Representative Results
Uma reacção positiva ocorre quando o látex de anticorpo específico de tipo ligado à partícula de látex liga-se a cápsula do pneumococo, e a aglutinação das partículas anticorpo marcado resulta 15. Figura 1A mostra uma reacção positiva, que é caracterizada por aglutinação e de limpeza de fundo suspensão. Uma reacção negativa é caracterizado por a suspensão reagente de aglutinação em látex remanescente suave e branco (Figura 1B). Os reagentes são optimizados de modo a que uma reacção positiva deve ser observada antes do fim do intervalo de tempo de um minuto (geralmente detectáveis em cerca de 20 seg). Nós não recomendamos a leitura reações após o intervalo de tempo de 1 min. Muito ocasionalmente, exibir reacções de aglutinação fracas em torno da borda da gota que não é acompanhada por compensação da suspensão de fundo, ou aparecem "fibroso", sem compensação de fundo (dados não mostrados). Estes são mais como reações negativas ly. Em tais casos, é recomendável um novo ensaio e / ou investigação adicional utilizando outro método serotipagem (por exemplo, a reacção de Quellung 17).
Figura 1. reações de aglutinação de látex positivos e negativos. Preparações dos pneumocócica isolar misturado com o reagente de aglutinação em látex, mostrando uma reação positiva (A) ou uma reação negativa (B). Aglutinação acompanhada por compensação do fundo é visto na reacção positiva (A) .há nenhuma aglutinação de látex com o reagente de controlo negativo ou de uma reacção de teste negativo (B). Fotografias 8 usada com permissão."Target =" _blank "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Discussion
Aglutinação em látex é um método simples, rápido e barato para sorotipagem pneumocócica. Comerciais pneumocócicas reagentes de aglutinação de látex estão disponíveis, mas que atualmente não fazem distinção todos os sorotipos de pneumococos conhecida 10,12. No entanto, reagentes de aglutinação de látex pode ser facilmente produzido em casa usando anti-soros comprado levantada contra antígenos capsulares de pneumococos específicos. No método aqui descrito, os anticorpos são passivamente ligado a partículas de látex para fazer um conjunto de reagentes de aglutinação de látex.
Uma reacção positiva ocorre quando o látex anticorpos específicos ligados às partículas de látex atribuem aos antigénios sobre a cápsula polissacarídica do pneumococo isolar 18,19. As partículas de látex ligados aos anticorpos permite a reacção anticorpo-antigénio específico a ser visualizado sem ampliação.
Aglutinação em látex é um método adequado para um elevado rendimento laboratóriosd também para locais com poucos recursos. As principais vantagens do método são de aglutinação em látex que não é necessário equipamento especializado para executar o teste, os reagentes têm um prazo de validade de pelo menos 2 anos, quando armazenados a 4 ° C, 8, e que é de baixo custo, simples e rápida de realizar. Serotipagem um isolado de pneumococos por aglutinação em látex leva aproximadamente 10 minutos, e até quatro reagentes de látex podem ser testadas em paralelo a uma lâmina. Além disso, se a prevalência de serotipos é conhecida para a configuração epidemiológica relevante, os testes podem ser realizados em rodadas começando com as piscinas que contêm os serotipos mais comuns de modo semelhante ao teste de Quellung 17. Esta abordagem minimiza o número de testes necessários para determinar o serotipo. O método também é altamente reprodutível entre diferentes operadores (dados não mostrados). Uma desvantagem de aglutinação em látex serotipagem é que a produção dos reagentes é demorado, tendo cerca de quatro horas; embora REAGE múltiplaes podem ser facilmente produzidos em paralelo. Além disso, alguns antígenos são comuns a diferentes sorotipos de pneumococo, resultando em reações cruzadas com alguns anti-soros (por exemplo, o sorotipo 29, 42 e Grupo 35). No entanto, estas reacções cruzadas estão bem caracterizados pelo uso comercial anti-soros (o que é normalmente pré-absorvido para remover os anticorpos de reacção cruzada mais problemáticos) e tabelas de reacção adicionais são fornecidos pelo fabricante, a fim de distinguir o que se encontra presente serótipo. Reagentes de látex pode também reagiram de forma cruzada se os anticorpos não estão alinhados adequadamente sobre as partículas de látex; estes são detectados como falhas QC. Na nossa experiência, rigoroso QC é central para o sucesso deste método, mesmo quando os anti-soros disponíveis comercialmente são usados para a produção. QC demora aproximadamente 15 min por reagente e depende de um conjunto de QC apropriada isolados como descrito acima.
O método aqui descrito resulta em reagentes que dão uma reacção positiva bem widiluir o período de teste. Na nossa experiência, os falsos positivos são raros, na prática, (dados não mostrados). Falsos negativos ocasionais são observadas; geralmente estes se relacionam com problemas conhecidos com um anti-soro específico (por exemplo, o sorogrupo 6 isolados não pode reagir com piscina B anti-soro), ou baixa regulação da expressão cápsula pelo isolado. Usando o algrorithm sorotipagem fornecido pelo fabricante também é importante, como na maioria dos casos, uma reação positiva ou negativa falsa levará a um resultado "final cego '. Nestes casos, e quando as reações são de difícil interpretação, recomendamos repetir-testes e / ou testes por um método alternativo, como a reação Quellung.
Alguns solução de problemas é por vezes necessária para fazer reagentes de látex satisfatórios. No método aqui descrito, o anticorpo é ligado a partículas de látex, através de adsorção passiva 15,19, então uma variável crítica é a concentração de anticorpo utilizado, o que determina quão bema superfície das partículas de látex é coberto e o subsequente alinhamento dos locais activos de anticorpos 15,20. Por conseguinte, se o anticorpo em excesso insuficiente ou está ligado às partículas de látex, as reacções antígeno-anticorpo não será óptimo, e reagentes insatisfatórias podem ser produzidos 15,20,21. Como os títulos de anticorpos variar entre diferentes lotes de soros, um conjunto padrão de diluições pode não produzir os reagentes que um bom desempenho 8. Um ponto de partida útil é a utilização de uma diluição 1:40 do anti-soro, se este não é bem sucedida, diluir ainda mais o anti-soro. Em nossa experiência, isso geralmente resolve o problema 8. Em um pequeno número de casos reagentes podem apresentar aglutinação fraca que não é acompanhada de compensação da suspensão, quando testado com alvo isolados. Nestes casos, a diluição de anti-soro não melhora a qualidade do reagente, mas reagentes satisfatórios podem ser geralmente produzidos por omitindo a centrifugação e passos de lavagem 8,22
Revestidas de anticorpo partículas de látex são usados comumente em microbiologia de diagnóstico para a detecção, identificação ou sorotipagem de muitos micróbios diferentes 15,20. Como tal, o método aqui descrito pode ser adequado para a preparação de reagentes de látex para outras finalidades, desde que os anti-soros adequados estão disponíveis e são adequados CQ adoptada.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microparticles based on polystyrene, 800 nm | Sigma | 65984-10 ml-F | Or other volumes as required |
| Normal rabbit serum | Antibodies Australia | NRS-1ml | Or other volumes as required, bring to RT before use |
| Pneumococcus (Neufeld) antisera | SSI Diagnostica | Various | Bring to RT before use http://www.ssi.dk/ssidiagnostica |
| Sterile Bovine Albumin | Sigma | A-4503 | Bring to rRT before use |
| Sodium azide 10% (v/v) solution | VWR International | ROAC3902/100ml | Caution: hazardous if inhaled; skin and eye irritant |
| Eppendorf Safe-Lock tubes, 2 ml | Eppendorf | 0030 120.094 | Round bottom |
| Sodium chloride | Merck | 10241.AP | |
| Calibrated disposable inoculating loops 1 µl | Copan | CD175SO1 | |
| Glass microscope slides 76 mm x 26 mm | Thermo Fisher Scientific | LBS 2950RC | |
| 5 M NaOH | BDH | 10252 | Caution: highly corrosive |
| Glycine | Merck | 10119.05 | |
| Horse Blood Agar (HBA) plates | Thermo Fisher Scientific | PP2001 | Bring to RT before use http://www.thermofisher.com.au |
| Rotating wheel | Wyble Engineering Development Corporation | ||
| Polystyrene flat bottom screw cap tube, 5 ml | Technoplas | S5016SU | |
| 60 ml syringes without needles | Terumo | SS-60L | |
| Millex-GP syringe filter unit, 0.22 µm | Merck Millipore | SLGP033RS | |
| Brochure on Neufeld antisera | Statens Serum Institut | Key to determining serotypes http://www.ssi.dk/ssidiagnostica |
|
| Key to pneumococcal factor serum | Statens Serum Institut | 18058 | For determining serotype within Groups http://www.ssi.dk/ssidiagnostica |
| *alternative sources are available for most materials |
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