Samtidige ekstracellulære langsiktige opptak fra to ulike hjerne neuropiles eller to forskjellige anatomiske traktater ble etablert i honningbier. Disse opptakene tillate etterforskningen av timelige aspekter av nevronale behandling på tvers av ulike hjerneområder på enkelt nervecelle samt på ensemble nivå i en oppfører dyret.
I begge pattedyr og insekter neuronal informasjon bearbeides i forskjellige høyere og lavere orden hjerne sentre. Disse sentrene er koblet via konvergent og avvikende anatomiske tilkoblinger inkludert fôr fram og tilbakemeldinger ledningsnett. Videre blir informasjonen fra den samme opprinnelsen delvis sendt via parallelle veier til forskjellige, og noen ganger i de samme hjerneområdene. For å forstå de evolusjonære fordeler så vel som de beregnings fordelene ved disse ledninger strategier og spesielt deres tidsmessige avhengigheter på hverandre, er det nødvendig å ha samtidig tilgang til enkelt nevroner i forskjellige trakter eller neuropiles i det samme preparatet med høy tidsoppløsning. Her konsentrerer vi oss om honningbier ved å demonstrere en unik ekstracellulære langsiktig tilgang til å spille inn flere enhet aktivitet ved to påfølgende neuropiles 1, antennal lapp (AL), den første lukteprosesstrinn og sjampinjong kroppen (MB), en høyere orden integrering sentrum involved i læring og hukommelse formasjon, eller to parallelle nevrale traktater 세스 forbinder AL med MB. Sistnevnte ble valgt som et eksempel og vil bli beskrevet i sin helhet. I bære video konstruksjonen og permanent innsetting av fleksible flerkanaltrådelektroder er demonstrert. Parvise differensialforsterkning av de mikrotrådelektrode kanaler drastisk reduserer støyen og verifiserer at kilden til signalet er nært knyttet til posisjonen til elektrodespissen. Den mekaniske fleksibiliteten av de brukte trådelektroder gir stabile invasive langtidsopptak i løpet av mange timer til dager, noe som er en klar fordel sammenlignet med konvensjonelle ekstra-og intracellulære in vivo opptaksteknikker.
Honeybees så vel som de fleste andre insekter sterkt avhengige av luktesans. Blant annet de bruker lukte stikkord for orientering, parring, kommunikasjon med conspecifics, og beite. Deres godt utdypet luktsystemet bidrar til et rikt repertoar av lærings atferd knyttet til blomsterluktstimuli. Disse atferd kan lett studert under kontrollerte laboratorieforhold (for gjennomgang se 3 – 5). Deres "mini hjerner" (cp. 6) med sine relativt lite antall nerveceller gjør honningbie en velegnet modellorganisme for å studere lukte koding og læring under overvåking av nevral aktivitet.
Den luktsystemet hos insekter så vel som i pattedyr viser analogt organisasjon i stor grad (for gjennomgang se 7,8). I honningbier ca 80000 reseptor nevroner 9 ligger i sensillae langs antennene 10,11 sette miljø lukt stimulans til en neuronal signal. Axoner fra olfactory reseptor neuroner innerverer antennal lobe (AL), som har en glomerulær organisasjon kan sammenlignes med den hos virveldyr luktelappen. Den AL består av ca 164 glomeruli koblet sammen med hverandre etter ca 4000 lokale interneurons (LN) (for gjennomgang se 12). Spesielt i honningbien har det blitt vist nylig at LNS gir flekkvis lateral tilkobling og at ulike subpopulasjoner besitter elementær og configural lukte koding egenskaper 13,14. Den AL ble vist å være inndelt i en ventral og en dorsal hemi lobe som gir opphav til den mediale og laterale antennal lobe kanalen (m-, og l-ALT, tidligere betegnet m-og l-APT for medial-lateral og antennal lobe protocerebral proselyttering 15 – 17). Her en ny kanalen terminologi innført av en nylig innsats for en enhetlig nomenklatur av insekt hjernen vil bli brukt 18. Begge alts (l-og m-ALT) kombinere enten 410 (l-ALAT) eller 510 (m-ALT) uniglomerular projeDette skjer nevroner (PN), henholdsvis 15,16,19. PNS av begge traktater har nylig vist seg å kode lukt i parallell 2 (for gjennomgang se 17,20), og begge traktater postsynaptisk danne avvikende forbindelser med Kenyon Cells (KC), sopp kroppen (MB) viktigste nevroner. Hver MB inneholder ca 172 000 KCs 21-23. MBS er kjent for å være involvert i stimulans integrering, læring og hukommelse formasjon. De AXO dendritter av KCs danne peduncle (sopp er stammen), som har to hovedutganger regioner: den Vertica eller alpha-lapp og den horisontale eller beta-lapp 22,24. Utgangen av MB konvergerer mot bare ca 400 ytre nevroner (EN) 24. ENS er ansvarlig for olfactory informasjonsbehandling for det meste innerverer den ventrale del av den vertikale lobe 22.. Nylig har det blitt vist at ENS registrert på dette området kode lukt belønning foreningen 25.
Temporal somutsikter i luktesystemet av insekter samt virveldyr har blitt en viktig og vesentlig aspekt som en potensiell koding prinsipp 26 – 29. For å være i stand til å samtidig ta opp flere nevroner fra ulike områder med høy tidsoppløsning, etablerte vi doble multi enhet opptaksteknikker ved hjelp av tilpassede multikanals trådelektroder introdusert til ulike målgrupper regioner i bee luktesystem. Denne tilnærmingen gjør oss i stand til å analysere og sammenligne tidsmessig behandling i honningbien luktsystemet på nivået av enkeltnerveceller og populasjoner av nerveceller enten mellom parallelle lukte trasé, dual lukte pathway 세스 eller mellom ulike påfølgende neuropils en. Nylig med en lignende eksperimentell tilnærming i locust luktsystemet 30 ved hjelp av en annen konfigurasjon av elektroder var i stand til å analysere tid og rom kodemekanisme for bakgrunn-lukt invariant gjenkjennelse 31.. Thoss, de etablerte dual opptak aktiverer samle romlig informasjon om samtidige nevronale aktivitetsprofiler.
Sammenlignet med den bredere romlig sampling hentet fra kalsium bildebehandling denne metoden gjør opptak fra to stedene bare. Imidlertid er fordelen i forhold til kalsiumavbildningsteknikker er den høye time presisjon på aksjonspotensial-opptak, som ikke kan leveres av enten konvensjonell CCD eller to-foton avbildning anskaffelse. De ekstracellulære elektroder som er beskrevet her er permanent implantert og festet i forhold til hjernen og hodekapsel unngå elektrodedrift. Dette er en klar fordel i forhold til bruken av skarpe intracellulære elektroder. En annen fordel i forhold til intracellulære opptak og kalsium bildebehandling er den utvidede nevrale observasjonstid alt fra mange timer opp til dager. Dette er en viktig forutsetning for å undersøke nevrale korrelater for læring og hukommelse formasjon. Ytterligere fordeler av multienhets innspillinger er videre beskrevet i diskusjonskapittelet.
I denne metodeoversikten produksjon prosedyren for tilpasset design trådelektroder vil bli vist, tilpasset fra 32,33 og egnet for langsiktig multi unit opptak i honningbien hjernen. I tillegg er et eksempel på hvordan slike elektroder er fast implantert på to forskjellige steder innenfor opptaks honningbie olfaktoriske system for å registrere samtidig, l-og m-ALT over lange tidsperioder for å tillate mange stimuleringsregimer er vist to. For verifisering av de mottatte posisjoner et eksempel og protokoll for farging og etter opptak visualisering av opptakssider er gitt.
Denne artikkelen viser fremstilling og bruk av spesialdesignet multikanalmikrotrådelektroder. De beskrevne elektroder er egnet for opptak både enkelt enhet og befolkningen aktivitet som er spesielt nyttig for latency målinger og andre timelige respons egenskapene til ulike nerveceller og ulike neuropils innenfor et enkelt eksemplar (for detaljer se 1,2,25). I tillegg har vi vist hvordan du permanent implementere mikrotrådelektroder å tillate stabile langsiktige opptak i oppfører honningbier som varer i timer opp til dager.
Ekstracellulære multi-unit opptakene ble et gunstig verktøy for å oppnå høy tidsoppløsning kombinert med romlig informasjon. I vårt tilfelle, disse er enten parallelle nevrale traktater 세스 eller to forskjellige neuropils en. Flere neuroner kan bli registrert og analysert på enkelt neuron nivået i parallell og ved høy tidsmessig oppløsning. Multi-unit rekordninger ble først brukt i pattedyr 38 og senere også i insekter 39-41. Betydelig fremgang ble oppnådd med utvikling og forbedring av ekstracellulære flerkanals opptak teknikker 42,43. Dette, for eksempel, omfatter utvikling av nye elektroder 44 eller romanen spike sorterings-og clustering algoritmer 45. Generelle metoder for ekstracellulære multi-enhets opptak teknikker er godt beskrevet 46 – 48. De selv bygget elektrodene som vises i denne videoen i tillegg kan tilpasses ved å legge til flere microwires pr elektrode eller mikro ledninger kan vris til å få målbare konstant avstand mellom spissene. Begge fremgangsmåter vil imidlertid føre til avtagende fleksibilitet og øke tykkelsen av elektroden.
Sammenlignet med silisium sonder som vanligvis brukes for ekstracellulære opptak i mye større insekter som hauken møll, gresshoppe og kakerlakk 40,49 – </sup> 51 de beskrevne mikrotrådelektroder er mindre fleksibelt og kan tåle lett med potensielle hjerne bevegelser, og dermed kan bli pålitelig brukes i små sosiale insekter som bier og maur som viser en mye bredere atferdsmessige repertoar. De silikon-sonder har skarpe skaftlignende strukturer skjære axoner og neural vev langs deres innføringskanalen, mens de beskrevne mikro ledninger er runde, fleksibel og mindre, og er derfor mindre skadelige for omgivende vev, som er en klar fordel dersom målet er å studere lang -begrepet plastisitet i en intakt og oppfører dyret. En annen fordel med mikrotrådelektroder er deres lave produksjonskostnader og enkel håndtering. I stedet for å nøye rengjøring en dyr silikon sonde elektrodetråder er nyklipt før hjernen innsetting og derfor mangel problemer med lunger. Videre er det mulig å bruke mer enn ett mikrotrådelektroder i samme preparat, enten satt inn i forskjellige neuropiles 1 or traktene 세스 som vi viser her. Denne tilnærmingen er spesielt gunstig å analysere og sammenligne timelige aspekter som respons ventetider og samhandling på ulike nevrale prosesseringsnivåer.
Vi er klar over det faktum at en ekstracellulær innspilte signal ikke reflekterer enkeltcelle-aktivitet per se. Det er alltid en forbindelse av spenningsaktiviteten rundt elektrodespissen. For å lokalisere kilden for signalet differansen av to nabomikrotråd kanaler innenfor en elektrode er alltid beregnet. Således kilde for pigg-signaler som benyttes til å trekke ut én enhet aktivitet var alltid meget nær den ene eller den andre elektroden kanalen resulterer i lett skjelnes pigg bølgeformer. Signaler fra lenger borte, slik som muskel-aktivitet eller aktivitet av nabo neuropils, når begge elektrodene samtidig fremkaller sammenlignbare former og amplituder og vil bli forkastet av denne fremgangsmåten. Bruke malen matchingsteknikk for Spike2,Vi er svært sikre å oppnå enkelt enhet aktivitet, som ikke er den samme, men svært nær én nervecelle-aktivitet. Men, kunne spørsmålet om spike sortering unngås ved hjelp av intracellulære opptak teknikker.
Encellete innspillinger med enten skarpe elektroder eller patch pipetter tillate inngående kunnskap om fysiologiske egenskapene til en enkelt nervecelle. Men på grunn av den lille størrelsen på insekt nevroner og deres neurites (f.eks., Mindre enn 1 mikrometer for honningbie PNS 52) bare kortsiktige innspillinger er håndterbare. Videre kan intracellulært opptak være invasiv og kan skade cellen som er muligens en annen grunn for de timelige begrensninger. In vivo intracellulære opptak i insekter sjelden overleve én time. En tidsvindu som var tilstrekkelig for det banebrytende arbeidet til Martin Hammer 53 som spilte intracellulær fra en enkelt identifisert nevron, ventral uparede maxilar nevron nr. 1 (VUMmx1). Han kunne link dens aktivitet direkte til belønning pathway. Juliane Mauelshagen 54 registrerte intracellulært aktiviteten til en identifisert sopp kroppen ytre nervecellen, den pedunculus ytre nevron nr. 1 (PE1) under klassisk betinging. Det samme nevron var i fokus for Menzel og Manz 55 da de fant LTP etter elektrisk stimulering av Kenyon Cells. Men Okada og kolleger 56 kunne bruke intracellulært godt karakterisert spiking mønster (doble og triple pigger) for identifisering av PE1 under ekstracellulære opptak. Tross alt en kombinasjon av begge metodene, kan intracellulære opptak fra identifiserte nevroner og ekstracellulære langsiktige opptak være et kraftig verktøy for fremtidige undersøkelser.
Men ved å bruke skarpe elektroder for å spille inn flere celler (enheter) samtidig på forskjellige nivåer gjennom mange timer opp til dager til å analysere sine time respons-forhold og / eller plast endringer ier nesten umulig.
Med den første kalsium bildebehandling tilnærminger i honningbien 57,58 hjelp kalsiumfølsomme fargestoffer analyse av romlige mønstre av lukt svar var tilgjengelig 59-62. Men i mange tilfeller kalsiumfølsomme fargestoffer har til å bli innført i hjernevevet via invasive manipulasjoner som igjen begrenser bie levetid og iboende egenskaper av de analyserte celler. Dette problemet er overvunnet i andre modellorganismer som banan bruker genetisk innført kalsium sensorer 63,64. Men generelt kan kalsium sensorer innføre andre begrensninger som de kan opptre som kalsiumbuffere som trolig påvirke tidsmessige egenskaper av lukt responser. Samtidige intracellulære innspillinger kombinert med kalsium bildebehandling eller beregnings tilnærminger kan bevise riktig tidsmessig oppløsning på bildeprosesser 65,66. Men tidsmessig oppløsning på bildeprosessen er Rather begrenset. Optiske oppkjøp systemer vanligvis bruker CCD-bildebehandling med en tidsmessig oppløsning på 5-20 Hz 67, selv om to-foton-Imaging kan være i stand til å tilegne seg raskere sekvenser 68. Imidlertid øker samplingsfrekvensen alltid går sammen med et tap i romlig oppløsning. Videre kalsiumfølsomme fargestoffer som brukes i honningen gjennomgå bleking, noe som også reduserer oppkjøps tid 69.
Sammenlignet med andre fysiologiske opptaksteknikker i insekter våre fleksible multikanals mikro-trådelektroder sikre lang tid tilgang til én enhet og befolkning neuronal aktivitet i oppfører bier.
Vi demonstrerte å bruke to av disse elektroder ved forskjellige behandlingstrinn i det samme dyr, som muliggjør analyse av temporale koding forhold mellom de forskjellige opptakssteder. Avhengig av den problemstilling og modellen insekt den grunnleggende metode for elektrode bygningen vist her er enkelt utvidestand og / eller kan tilpasses. For eksempel er det mulig å anvende flere enn de tre enkelttråder for å produsere flerkanals elektroder. I tillegg kan antall registrerings områder bli utvidet og observere tidsmessige aspekter ved flere enn to trakter eller neuropils er gjennomførbart. Vårt håp er at denne metoden vil inspirere mange forskere og vil bidra positivt til forståelsen av sofistikerte nevronale behandling i små hjerner.
The authors have nothing to disclose.
The authors would like to thank Isabelle Reus for establishment of tracing the electrode insertion side, Tobias Rosenbaum for LabView programming, Anneke Meyer for data analyzes and helpful discussions. We thank Randolf Menzel for discussion and practical help during early stage of electrode development. Furthermore we thank Brian Smith for postdoctoral association to MS-B. This work was supported by the Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, SPP 1392, Ro1177/5-2) to WR.
Paraffin oil | Fluka | 76235 | |
Odors | Sigma Aldrich | ||
PBS | pH 7.2 | ||
4% Formaldehyde | ThermoScientific | 28908 | Methanol free |
Triton X | BioChemica | A1388 | |
Methylsalicylate | Roth | 4529.1 | |
Tetramethylrhodamin dextran, 10,000 MW (Microruby) | Invitrogen | D7162 | keep dark |
Alexa 488 hydrazide | Invitrogen | A-10436 | keep dark |
Alexa 568 hydrazide | Invitrogen | A-10437 | keep dark |
Bee Ringer Solution | see 2 | ||
Polyurethane-coated copper wire | Elektrisola | 15µm diameter & P155 insulation | |
Dental Wax | Densply Detrey | 64103015S1 | moderate melting point |
Dental Wax | Flexaponal | 124-202-00 | low-melting Wax |
KWIK SIl | WPI | 03L | |
18 Pin Socket | Conrad Electronic | 189634-62 | |
Hot melting glue | Conrad Electronic | 827673 | |
soldering needle | Conrad Electronics | 830283 | 12 V |
Soldering terminal lug | Conrad Electronic | 531901 | |
Glaselectrodes | WPI | 1B100F-3 | |
Minutien Pins | Fine Science Tools | 26002-20 | V2A 0.2 x 12 mm |
switchable headstage | Tucer Davis Technologies | SH16 | |
Headstage connection module | NPI | INT-03M | |
Amplifier Module | NPI | PDA-2F | |
Data Acquisition boards | National Instruments | NI-6123, Ni-6143 | |
Acquisition Software | National Instruments | Lab View 8.2 | custom design |
Spike-Sorting | CED | Spike 2 v7.11 | |
Matlab | Mathworks | R2008B | |
Micromanipulator | Leitz | manual | |
AG-wires | WPI | AGT05100 | |
Confocal laser scanning microscope | Leica | TCS SP2 AOBS | |
AMIRA | Mercury Computer Systems | 2/5/2000 |