마우스 도파민 뉴런의 차 문화
Summary
Dopaminergic neurons play a vital regulatory role in the brain. Their loss is associated with Parkinson’s disease. In this video, we show how to generate primary cultures of central dopaminergic neurons from embryonic mouse mesencephalon. Such cultures are useful to study the extreme vulnerability of these neurons to various stresses.
Abstract
도파민 뉴런은 뇌 신경 세포의 총 수의 1 % 미만을 나타낸다. 신경이 적은 양의은 모터 제어, 동기 부여, 및 작업 메모리 중요 뇌 기능을 조절한다. 흑질 선조체 도파민 뉴런 선택적 파킨슨 병 (PD)에 퇴화. 이 진보적 인 신경 세포의 손실은 명백하게 병리의 모터 증상 (운동 완만, 휴식 진전, 근육 강도)와 연결되어 있습니다. 도파민 신경 세포의 변성을 담당하는 주요 에이전트는 아직 알 수 없습니다. 그러나 이러한 신경 세포는 다양한 조건에서 매우 취약한 것으로 나타납니다. 차 문화는 속성과 도파민 신경 세포의 특성을 조사하기 위해 가장 중요한 모델 중 하나를 구성한다. 이러한 문화는 중지하거나 신경 세포의 변성을 느리게하기 위해 PD 병리를 모방 다양한 스트레스 에이전트 및 신경 보호 화합물을 제공 할 수 있습니다. GENER왔다 PD의 수많은 형질 전환 마우스 모델지난 10 년간 나타나는데 더 도파민 신경 세포 배양에 대한 연구자들의 관심이 증가했다. 여기서, 비디오 프로토콜은 배아 마우스 뇌의 섬세한 절개에 초점을 맞추고있다. 복부 중뇌의 정확한 절제 후속 연구를 할 수 있도록 도파민 세포에서 충분히 풍부한 신경의 문화를 얻기 위해 매우 중요합니다. 이 프로토콜은 배아 형질 전환 마우스 실현 면역 형광 염색, 정량 PCR, 둘째 메신저 정량화, 또는 신경 세포의 죽음 / 생존 평가에 적합하다 할 수 있습니다.
Introduction
도파민, 필수적인 뇌의 신경 전달 물질 1,2 중 하나는, 주로 중뇌 도파민 (DA) 신경 세포에 의해 방출된다. DA 신경 세포의 대부분은 중뇌 2-6의 복부 부분에 상주. mesostriatal, mesolimbic 및 mesocortical 경로 2,5 : 도식적으로, 중뇌 DA 뉴런은 해부학 적 및 기능적으로 세에서 별개의 프로젝션 시스템을 나눌 수 있습니다. 전두엽 피질에 투사 도파민 경로는 인식이 연루되는 반면, 흑질 선조체 경로는 mesolimbic 경로 보강, 동기 부여, 학습에 중요한 역할을, 모터 동작에 참여하고있다.
DA 뉴런은 정신 분열증, 주의력 결핍, 하이퍼 활동 장애, 파킨슨 병 (PD) 2,4 등 여러 가지 인간의 신경 질환에 참여하고 있습니다. PD는 흑질 접속 DA 신경 세포의 진행성 및 퇴행성 선택적 특징선조체에 갈 거예요의 compacta (SNC). PD의 운동 증상의 책임이있는 선조체 (striatum)에서 심각한 도파민 고갈에 nigro – 선조체 DA 뉴런 결과의 손실 (운동 완만, 휴식 진동, 강성) 7. 특발성 PD의 초기 원인은 확립되지 않았으며, 현재 치료 선조체 도파민 수준을 복원하는 목표 만 증상이다. 대부분의 처방 약은 L-도파 (레보도파), 도파민의 자연 전구 물질이다. 레보도파의 투여가 일정 시간 동안 도파민 손실을 보상하지만, 모터 후 합병증 (운동 이상증의 온 / 오프 상태) 장기간 치료 8,9 일어난다.
도파민 뉴런과 PD에 대한 연구가 진행되어 일정 강렬한 노력은 세포 이식, 유전자 치료, 또는 신경 보호제 10,11에 기반 치료법을 개발하기 위해 이루어지고있다. 단, 중요한 문제가 아닌 해명 남아 극단적 vulnerab의 원인이 무엇DA 뉴런의 ility? 답변의 일부는 DA 신경의 활성에서 찾을 수있다. 전기적 활동 및 DA 신경 세포의 흥분성의 감소는 12 퇴화하는 그들의 성향을 확대 할 것으로 보인다. 그럼에도 불구하고, PD의 병인의 복잡성 DA에 관여하는 메커니즘 신경 세포가 13 ~ 15 변성을 식별하기 위해 추가 연구가 필요합니다.
차 문화는 DA 신경 세포의 특성 16 ~ 19을 공부하고 신경 보호제 20-24의 평가를 위해 다양한 스트레스에 이러한 뉴런에 도전 특히 적합하다. 쥐 배양 모델은 대부분 쥐 배아 중뇌의 박리가 용이 한, 마우스와 비교하고, 뉴런의 더 많은 양이 쥐에서 얻을 수있다 사용된다. 그러나, 병 (25)의 형질 전환 마우스 모델의 생성은 마우스에서 26-29 차 배양 용 신경학 커뮤니티의 관심을 상당히 증가하고있다. 홍보 문화 있지만신생아 동물로부터 epared은 뉴런 분화하는 능력을 유지 한 경우, 포스트 – 유사 분열 단계 (중뇌 신경 용 E13.5)에서 배아을 준비하는 것이 좋다, 사용될 수있다. 다음 프로토콜은 준비하기가 가장 어려운 마우스 배아 (E13.5)에서 차 문화에 고립 된 중뇌의 신경 세포를 제공합니다. 특히, 우리는 더 나은 재현성 위해 무 혈청 배지를 사용하는 프로토콜을 제공한다. 배양 제제 (해부 및 기계적 해리)에 두 개의 가장 중요한 단계는 신중 연관된 비디오에 설명 될 것이다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 프로토콜은 마우스 배아 도파민 성 신경 세포를 검출하는 면역 형광 절차에서 중간 뇌 신경 세포의 일차 배양을 준비하기 위해 필요한 절차 및 시약을 제공한다. 절차의 중요한 단계는 배아의 박리 및 회수 뇌 절편 기계적 해리이다. 고품질 해부 악기 해부 기술을 마스터하는 데 도움이됩니다. DA 뉴런 중뇌의 작은 부분을 구성한다. 따라서, 복부 중뇌의 오른쪽 부분을 수집하는 DA 뉴런 2-4 % 함?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Supported by grants from CNRS and INSERM. PM acknowledges support from the Fondation pour la Recherche Médicale en France (Equipe FRM 2009). SC acknowledges support from the Fondation de France.
Materials
| Fetal Bovine Serum | Lonza | 14-801F | |
| DMEM 4.5g/L Glucose with L-Glutamine | Lonza | BE12-604F | |
| 0.05% Trypsin-EDTA (1X), Phenol Red | Life Technologies | 25300-054 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Life Technologies | 15140122 | |
| L-glutamine, 200 mM Solution | Life Technologies | 25030123 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/Nutrient Mixture F-12 Ham | Sigma-Aldrich | D0547 | Powder |
| Laminin – 1 mg/mL in Tris buffered NaCl | Sigma-Aldrich | L2020 | |
| Poly-L-Ornithine hydrobromide | Sigma-Aldrich | P3655 | |
| Insulin from porcine pancreas | Sigma-Aldrich | I5523 | |
| apo-Transferrin human | Sigma-Aldrich | T1147 | |
| Putrescine dihydrochloride | Sigma-Aldrich | P5780 | |
| Progesterone | Sigma-Aldrich | P8783 | |
| Sodium selenite | Sigma-Aldrich | S5261 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G7126 | Stock solution 1M in water |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G9391 | Stock solution 2% (w/v) in water |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8532 | |
| Paraformaldehyde 16% in water | Electron Microscopy Sciences | RT 15710-S | |
| Sodium hydrogen carbonate (NaHCO3) | Merck Millipore | 106329 | |
| D(+)-Glucose, Monohydrate | Merck Millipore | 4074-2 | |
| Hydrochloric acid – c(HCl) = 1 mol/l (1 N) Titripur | Merck Millipore | 109057 | |
| Sterile water – Aqua B. Braun | Braun | ||
| Ethanol absolute NORMAPUR analytical reagent | VWR | 20821.321 | |
| Sterile Petri Dishes | VWR | 82050-566 | |
| Pasteur pipettes plain glass – Wilhem Ulbrich GdbR. | VWR | 612-2297 | |
| Counting chamber Malassez | VWR | 631-0975 | |
| Serum Acrodisc Syringe Filter with Supor Membrane, Sterile, GF/0.2 µm, 37 mm | PALL Life science | 4525 | |
| Surgical Scissors – Straight, sharp-sharp, 14.5 cm long | Fine Science Tools | 14002-14 | To open the abdominal wall |
| Scissors – Straight, pointed, delicate, 10 cm long | MORIA | 4877A | To open the uterine wall |
| Forceps – Curved, usual, serrated jaws 1 mm | MORIA | 2183 | To manipulate embryos |
| Vannas Scissors – Curved, pointed, 7 mm blades | MORIA | MC50 | To take out the mesencephalon |
| Ultra Fine Forceps – Curved, delicate, 13 cm long | MORIA | 9987 | To remove meninges |
| BD BioCoat Poly-D-Lysine 24-well Multiwell Plates | BD Bioscience | 356414 | |
| BD Falcon 12-well Cell Culture Plate, flat-bottom with lid | BD Bioscience | 353043 | |
| SuperFrost Microscope Slides, Ground edges 90º | MENZEL-GLÄSER | AG00008032E | |
| Precision cover glasses thickness No. 1.5H circular 18 mm Ø | MARIENFELD | 117580 | |
| Polyclonal Rabbit Anti-Microtubule-Associated Protein 2 (MAP2) Antibody | Chemicon Millipore | AB5622 | 1/200 |
| Monoclonal Mouse Anti-Glutamate Decarboxylase (GAD67) Antibody, clone 1G10.2 | Chemicon Millipore | MAB5406 | 1/400 |
| Monoclonal Rat Anti-Dopamine Transporter (DAT) Antibody, clone DAT-Nt | Chemicon Millipore | MAB369 | 1/500 |
| Monoclonal Mouse Anti-5-HT Antibody | 1/8,000 – Generous gift from Yves Charnay (Swizerland, Yves.Charnay@hcuge.ch) | ||
| Goat Serum, New Zealand Origin | Life Technologies | 16210-064 | |
| Alexa Fluor 405 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody | Life Technologies | A-31556 | 1/200 |
| Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody | Life Technologies | A-11001 | 1/1000 |
| Alexa Fluor 594 Goat Anti-Rat IgG (H+L) Antibody | Life Technologies | A-11007 | 1/1000 |
| VECTASHIELD HardSet Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1400 | |
| Stereomicroscope | Carl Zeiss microscopy | Stemi-2000C | |
| Bunsen Burner FIREBOY | VWR | 451-0136 |
References
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