To shed light on the cellular and molecular mechanisms of zebrafish adult neurogenesis and regeneration, we developed a protocol for invasive surgery causing mechanical injuries in the zebrafish adult telencephalon and subsequent monitoring of changes in the stabbed hemisphere by immunohistochemistry or in situ hybridization.
Voksen zebrafisk har en forbløffende evne til at regenerere deres centrale nervesystem efter skade. For at undersøge det cellulære respons og de molekylære mekanismer, der er involveret i zebrafisk voksen centralnervesystemet (CNS) regenerering og reparation, har vi udviklet en zebrafisk model af voksne telencephalic skade.
I denne tilgang, vi manuelt generere en skade ved at skubbe til en insulinsprøjte nål i zebrafisk voksen telencephalon. På forskellige indlæg skade dage, fisk aflivet, deres hjerner dissekeres ud og farves ved immunhistokemi og / eller in situ-hybridisering (ISH) med passende markører til at observere celleproliferation, gliogenesis og neurogenese. Den kontralaterale unlesioned halvkugle tjener som en intern kontrol. Denne metode kombineret med f.eks RNA dyb sekventering kan hjælpe til at screene for nye gener med en rolle i zebrafisk voksen telencephalon neurogenese, regenerering og reparation.
Pattedyr har en meget begrænset kapacitet til at generere nye neuroner i løbet af voksenlivet, og voksen neurogenese i hjernen er for det meste begrænset til to telencephalic regioner beliggende ved subventricular zone (SVZ) i de laterale ventrikler, og subgranular zone (SGZ) i tandet gyrus i hippocampus 1. Pattedyr kan heller ikke reparere skader på hjernen forårsaget af neurodegenerative sygdomme, slagtilfælde eller skader effektivt. Lost neuroner erstattes ikke, og i stedet spredning af forskellige typer af gliaceller, herunder astrocytter, mikroglia og oligodendrocytter overholdes. Som en konsekvens af denne proliferativ proces kaldes reaktiv gliose, er de sårede hjernevæv afspærret af dannelsen af en glial ar, som hæmmer neuronale og axonal regenerering 2-4.
I modsætning til pattedyr, benfisk som zebrafisk danne nye neuroner rigeligt i voksne stadier og har en høj regenerative og proliferative potentiale til at reparere læsioner i centralnervesystemet 2,5-7. Zebrafisk voksne hjerne indeholder 16 distinkte neurale stamceller nicher, der genererer et stort antal nye neuroner i hele levetid 8-11. Neuroner født i disse specifikke sprednings zoner af den voksne zebrafisk hjerne vandrer til deres målområder, hvor de vil modnes og integrere i de eksisterende neuronale netværk 8,10,12-15.
Blandt progenitor zoner er identificeret i voksen zebrafisk den telencephalic ventrikulær zone er en af de mest undersøgte neuronale stamceller nicher. Celler i denne stamfader niche kan inddeles i tre forskellige typer med hensyn til deres morfologi, division sats og udtryk af forskellig glial eller neuronale markører. Type I og type II-celler radial glia lignende celler, som har lange processer. De udtrykker stamceller markører herunder GFAP, nestin og S100β. Type I celler ikke proliferere medens type II-celler proliferate langsomt, som det fremgår af deres udtryk for spredning markører såsom prolifererende celler (PCNA) og indarbejdelse af desoxythymidine analoger. Type III celler hurtigt dividere celler, der er forpligtet til at blive neurale forfædre og udtrykke neurale markørgener, såsom PSA-NCAM 5,16.
Skønt de regenerative kapacitet benfisk er veldokumenteret, har kun få publikationer beskrevet og undersøgt i detaljer de cellulære og molekylære mekanismer involveret i neuronal regenerering i den voksne telencephalon reaktion på skade 15,17-22. At dechifrere de mekanismer, der er impliceret i zebrafisk voksen centralnervesystemet regenerering og reparation og til at forstå ligheder og forskelle mellem konstitutive og regenerativ neurogenesis udviklede vi en zebrafisk model af voksne telencephalic skade. Her vil vi beskrive visuelt hvordan man kan generere en skade i en af de telencephalic hemisphEres ved hjælp af en kanyle, samtidig med at den kontralaterale unlesioned side som en intern kontrol. Vi vil også vise, hvordan man kan overvåge ændringer efter skade i celledeling og genekspression ved immunhistokemi og in situ hybridisering assays.
Vi beskriver her en metode til at inducere et telencephalic skade ved at skubbe en nål gennem kraniet af den voksne zebrafisk, og til at analysere den cellulære og molekylære reaktion på denne skade ved immunhistokemi og in situ hybridisering. Den største fordel ved denne teknik i forhold til andre eksisterende metoder er dets enkelhed, hastighed og omkostningseffektivitet. Derfor kan denne teknik, der tillader produktion af mange kvæstede hjerner i en kort tid, let kombineres med en storstilet in situ-hybridisering skærmen for at identificere gener med en rolle i regenerering og neurogenese.
Alderen på den voksne zebrafisk, hvor skaden er udført, er afgørende. Hvis fisken er ældre end 1,5 år kraniet er for hårdt, og det er muligt, at skallen bliver skubbet ned eller brækkede snarere end rent perforeret. I modsætning hertil yngre fisk (yngre end 4 måneder), er der stadig en masse af neurogenese foregår, hvilket kan lead til falske positive resultater med hensyn til reaktiv neurogenesis.
Et andet afgørende skridt i denne tilgang er at kontrollere effektiviteten af stiksår og udelukke, at begge hjernehalvdele er såret. Dette kan overvåges ved farvning af sektioner med anti-PCNA-antistof. I et korrekt introduceret læsion bør PCNA være betydeligt opreguleret i kun én af de halvkugler.
Det er vigtigt at huske på, at den inducerede mekanisk skade vil have flere bivirkninger såsom ikke-specifik celle ablation, øget celledød på grund af sekundær degeneration, inflammation og destruktion af blod-hjerne-barrieren, og beskadigelse af ventrikulær zone og som en mulig konsekvens strøm af cerebrospinalvæsken i hjernen parenkym. Men de sårede fisk vises, til at lide meget lidt fra skaden. Inden for 2 min, de er fritsvømmende igen og normal fodring adfærd er genoprettet inden for ca 4 timer. Efter 3 uger injury morfologisk ikke længere synlig. I vores hænder, fra flere hundrede operationer vi ikke mister en eneste fisk på trods af at vi havde en skade på 100% som vurderet ved histologi på 5 dage efter læsion.
I de seneste år er der udviklet andre teknikker, såsom transgene tilgange i zebrafisk til at producere væv eller celletype specifik ablation 2. Selv om disse teknikker er meget elegant og minimalt invasive de er baseret på den generation af komplicerede DNA-konstruktioner og etablering af flere stabile zebrafisk transgene linier, som kan være meget besværligt og tidskrævende. Derfor simple mekaniske tilgange såsom analysen beskrevet i denne protokol fortsat være et vigtigt værktøj til at studere voksne hjerne neurogenese og regeneration.
The authors have nothing to disclose.
We thank N. Borel and her fish house team, M. Rastegar for help with microscopy, and T. Dickmeis for comments on the manuscript. We are grateful for support by the EU IP ZF-Health, FP7-HEALTH-2007-B2, NeuroXsys, the Interreg Network for Synthetic Biology in the Upper Rhine valley (NSB-Upper Rhine) and the BMBF funded network EraSysBio.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Tricaine | Sigma | 335.2 | |
10x DPBS (-/-) | Life technologies | 14200-083 | |
30 G syringe (Omnican 40) | B.Braun Melsungen | 916162 | |
Polyethylene molding cup tray | Polysciences, Inc | 17177C-3 | |
PeqGOLD Universal Agarose | Peqlab | 35-1020 | |
Bovine serum albumin | Biochrom | W 2835919108 | |
Aqua Poly/Mount | Polysciences, Inc | 18606-20 | |
Tween 20 | Carl Roth | 9127.1 | |
DMSO | Carl Roth | A994.2 | |
Dissection needle | Carl Roth | KX93.1 | |
Paraformaldehyde | Carl Roth | 335.2 | |
Loctite 414 | Schöffler und Wörner | 06 1362 0020 | |
Glass slides | Labonord | 5305103 | |
Cover slips 24 x 60 mm | Labonord | 5305060 | |
Petri dishes 94 mm | Greiner bio-one | 632180 | |
Falcons 15 ml | Greiner bio-one | 188261 | |
24-well plate | Greiner bio-one | 662160 | |
Anti-S100 (1:500) | Dako | Z031101-2 | |
Anti-PCNA (1:400) | Dako | M087901 | |
Anti-GFP (1 :1000) | Aves Labs | GFP-1020 | |
anti-Dig AP-coupled antibody | Roche Diagnostics | 11093274910 | |
5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate (BCIP) | Roche Diagnostics | 1383221 | |
4-Nitroblue tetrazolium chloride (NBT) | Roche Diagnostics | 1383213 | |
Proteinase K | Roche Diagnostics | 1092766 | |
Polyethylene molding cup tray | Polysciences | 17177C-3 | |
Vibratome VT1000S | Leica | ||
Confocal microscope Sp5 DM6000 | Leica | ||
Dissecting microscope Nikon SMZ 645 | Nikon | ||
24-well flat bottomed tissue culture plates | Falcon catalog | 353226 | |
Student Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 91150-20 | |
Surgical scissors | Fine Science Tools | 91460-11 | |
Danio rerio Tg(olig2:EGFP) | 24 | ||
Danio rerio WT strains (e.g. AB2O2) |