To shed light on the cellular and molecular mechanisms of zebrafish adult neurogenesis and regeneration, we developed a protocol for invasive surgery causing mechanical injuries in the zebrafish adult telencephalon and subsequent monitoring of changes in the stabbed hemisphere by immunohistochemistry or in situ hybridization.
الزرد الكبار لديهم قدرة مذهلة على تجديد الجهاز العصبي المركزي على بعد الاصابة. للتحقيق في استجابة الخلايا والآليات الجزيئية المشاركة في الزرد الكبار الجهاز العصبي المركزي (CNS) تجديد وإصلاح، وضعنا نموذجا الزرد من إصابة الدماغ الانتهائي الكبار.
في هذا النهج، ونحن يدويا توليد إصابة عن طريق دفع إبرة حقنة الأنسولين في الدماغ الانتهائي الكبار الزرد. في أيام مختلفة إصابة آخر، يتم التضحية الأسماك، يتم تشريح أدمغتهم وملطخة بواسطة المناعية و / أو الموقع التهجين (ISH) في مع علامات المناسبة لمراقبة تكاثر الخلايا، gliogenesis، وتكوين الخلايا العصبية. يخدم نصف الكرة unlesioned المقابل باعتبارها الرقابة الداخلية. هذا الأسلوب مجتمعة على سبيل المثال مع الحمض النووي الريبي التسلسل العميق يمكن أن تساعد على الشاشة لجينات جديدة مع دورا في تكوين الخلايا العصبية الدماغ الانتهائي الزرد الكبار، وتجديد، وإصلاح.
الثدييات لديها قدرة محدودة للغاية لتوليد خلايا عصبية جديدة خلال حياة البالغين، والخلايا العصبية في الدماغ الكبار ويقتصر في الغالب إلى منطقتين الدماغ الانتهائي تقع في منطقة subventricular (SVZ) من البطينين الوحشي، والمنطقة جزئي التحبب (SGZ) من المسنن التلفيف في الحصين 1. الثدييات أيضا لا يمكن إصلاح الضرر في الدماغ الناجم عن الأمراض العصبية والسكتة الدماغية، أو إصابات، بكفاءة. لا يتم استبدال الخلايا العصبية المفقودة وبدلا انتشار أنواع مختلفة من الخلايا الدبقية، بما في ذلك الخلايا النجمية، الخلايا الدبقية الصغيرة، و oligodendrocytes، ويلاحظ. نتيجة لهذه العملية التكاثري دعا دباق رد الفعل، وختم أنسجة المخ أصيب قبالة عن طريق تشكيل ندبة الدبقية، الذي يثبط الخلايا العصبية وتجدد المحاور 2-4.
وعلى النقيض من الثدييات والأسماك مكتملة العظام مثل الزرد تشكيل الخلايا العصبية الجديدة بوفرة في مراحل الكبار ولها التجدد العالية وتتكاثرإيف المحتملة لإصلاح آفات الجهاز العصبي المركزي 2،5-7. الدماغ الكبار الزرد يحتوي على 16 منافذ متميزة العصبية الخلايا الجذعية التي تولد عدد كبير من الخلايا العصبية الجديدة أثناء الحياة بأكملها 8-11. الخلايا العصبية ولدت في هذه المناطق انتشار محددة من الدماغ الزرد الكبار الهجرة إلى المناطق المستهدفة، حيث أنها سوف تنضج والاندماج في الشبكات العصبية القائمة 8،10،12-15.
بين مناطق السلف المحددة في الزرد الكبار، ومنطقة البطين الدماغ الانتهائي هي واحدة من الخلايا العصبية محاريب الخلايا الجذعية الأكثر دراسة. ويمكن تصنيف الخلايا المتخصصة في هذا السلف إلى ثلاثة أنواع متميزة فيما يتعلق التشكل، ومعدل الانقسام والتعبير عن الدبقية مختلفة أو علامات العصبية. النوع الأول والنوع الثاني هي الخلايا الدبقية شعاعي مثل الخلايا التي لها عمليات طويلة. يعبرون عن علامات الخلايا الجذعية بما في ذلك GFAP، nestin، وS100β. النوع الأول الخلايا لا تتكاثر بينما النوع الثاني الخلايا تتكاثره ببطء، كما يتضح من التعبير عنها من علامات انتشار مثل تكاثر الخلايا مستضد النووي (PCNA) وإدماج نظائرها desoxythymidine. نوع الخلايا سريعة الانقسام الثالث والخلايا التي ملتزمون تصبح الأسلاف العصبية والتعبير عن الجينات علامة العصبية، مثل PSA-NCAM 5،16.
على الرغم من أن قدرات التجدد من الأسماك مكتملة العظام موثقة توثيقا جيدا، وقد وصفت سوى عدد قليل المطبوعات والتحقيق في تفاصيل الآليات الخلوية والجزيئية المشاركة في تجديد الخلايا العصبية في الدماغ الانتهائي الكبار في استجابة لإصابة 15،17-22. فك آليات الكبار المتورطين في الزرد تجديد الجهاز العصبي المركزي وإصلاح وفهم أوجه الشبه والاختلاف بين الخلايا العصبية التأسيسية والتجدد، وضعنا نموذجا الزرد من إصابة الدماغ الانتهائي الكبار. هنا، فإننا سوف تصف بصريا كيفية توليد اصابة في واحدة من hemisph الدماغ الانتهائيإزدان العقارية بمساعدة إبرة حقنة، مع الحفاظ على الجانب المقابل unlesioned باعتبارها الرقابة الداخلية. ونحن سوف تظهر أيضا كيفية رصد التغيرات على إصابة في تكاثر الخلايا والتعبير الجيني من قبل المناعية والمقايسات في الموقع التهجين.
نحن هنا وصف الأسلوب للحث على إصابة الدماغ الانتهائي عن طريق دفع الإبرة من خلال الجمجمة من الزرد الكبار، وتحليل رد فعل الخلوية والجزيئية لهذه الإصابة من قبل المناعية والتهجين في الموقع. الميزة الرئيسية لهذه التقنية على النهج القائمة الأخرى هو بساطته والسرعة والكفاءة من حيث التكلفة. لذلك، هذه التقنية، والذي يسمح إنتاج العديد من أدمغة المصابين في وقت قصير، ويمكن الجمع بسهولة مع نطاق واسع في الموضع الشاشة التهجين لتحديد الجينات التي لها دور في تجديد وتكوين الخلايا العصبية.
عمر الزرد الكبار التي تتم الإصابة أمر بالغ الأهمية. إذا كان السمك تكون أقدم من 1.5 سنوات، والجمجمة من الصعب جدا وأنه من الممكن أن يتم دفع الجمجمة أو كسر أسفل بدلا من مثقب نظيفة. في المقابل، في الأسماك الأصغر سنا (أصغر من 4 أشهر)، لا يزال هناك الكثير من الخلايا العصبية مستمرة، والتي قد لياد إلى نتائج إيجابية كاذبة بشأن تكوين الخلايا العصبية على رد الفعل.
آخر خطوة حاسمة في هذا النهج هو للتحقق من كفاءة الجرح طعنة واستبعاد أن كلا نصفي الكرة الأرضية والجرحى. هذا يمكن رصدها من قبل تلطيخ المقاطع مع الأجسام المضادة لمكافحة PCNA. في آفة قدم بشكل صحيح، يجب أن يكون بكنا بشكل ملحوظ التنظيم في واحدة فقط من نصفي الكرة الأرضية.
من المهم أن نضع في اعتبارنا أن الإصابة الميكانيكية الناجمة سيكون لها العديد من الآثار الجانبية مثل الاجتثاث غير محددة الخلايا، وزيادة موت الخلايا بسبب انحطاط الثانوية، والتهاب وتدمير حاجز الدم في الدماغ، والضرر من منطقة البطين وكما ممكن نتيجة لتدفق السائل النخاعي في الدماغ حمة. ومع ذلك، يبدو أن الأسماك الجرحى يعانون القليل جدا من الإصابات. في غضون 2 دقيقة هم السباحة الحرة مرة أخرى ويتم استعادة سلوك التغذية الطبيعية في غضون 4 ساعة. بعد 3 أسابيع طnjury هو شكليا غير مرئية بعد الآن. في أيدينا، من عدة مئات العمليات الجراحية أننا لم نفقد سمكة واحدة على الرغم من أن كان لدينا معدل الإصابة بنسبة 100٪ وفقا لتقييم الأنسجة في 5 أيام آخر الآفة.
في السنوات الأخيرة تم تطوير تقنيات أخرى مثل النهج المعدلة وراثيا في الزرد لإنتاج أنسجة أو نوع من الخلايا الاجتثاث محددة 2. على الرغم من أن هذه التقنيات هي أنيقة جدا والحد الأدنى الغازية لأنها تستند إلى توليد بنيات الحمض النووي معقد وإنشاء العديد من خطوط المعدلة وراثيا الزرد مستقرة والتي يمكن أن تكون شاقة للغاية وتستغرق وقتا طويلا. وبالتالي، نهج الميكانيكية البسيطة مثل الفحص الموصوفة في هذا البروتوكول تظل أداة مهمة لدراسة الخلايا العصبية في الدماغ الكبار والتجدد.
The authors have nothing to disclose.
We thank N. Borel and her fish house team, M. Rastegar for help with microscopy, and T. Dickmeis for comments on the manuscript. We are grateful for support by the EU IP ZF-Health, FP7-HEALTH-2007-B2, NeuroXsys, the Interreg Network for Synthetic Biology in the Upper Rhine valley (NSB-Upper Rhine) and the BMBF funded network EraSysBio.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Tricaine | Sigma | 335.2 | |
10x DPBS (-/-) | Life technologies | 14200-083 | |
30 G syringe (Omnican 40) | B.Braun Melsungen | 916162 | |
Polyethylene molding cup tray | Polysciences, Inc | 17177C-3 | |
PeqGOLD Universal Agarose | Peqlab | 35-1020 | |
Bovine serum albumin | Biochrom | W 2835919108 | |
Aqua Poly/Mount | Polysciences, Inc | 18606-20 | |
Tween 20 | Carl Roth | 9127.1 | |
DMSO | Carl Roth | A994.2 | |
Dissection needle | Carl Roth | KX93.1 | |
Paraformaldehyde | Carl Roth | 335.2 | |
Loctite 414 | Schöffler und Wörner | 06 1362 0020 | |
Glass slides | Labonord | 5305103 | |
Cover slips 24 x 60 mm | Labonord | 5305060 | |
Petri dishes 94 mm | Greiner bio-one | 632180 | |
Falcons 15 ml | Greiner bio-one | 188261 | |
24-well plate | Greiner bio-one | 662160 | |
Anti-S100 (1:500) | Dako | Z031101-2 | |
Anti-PCNA (1:400) | Dako | M087901 | |
Anti-GFP (1 :1000) | Aves Labs | GFP-1020 | |
anti-Dig AP-coupled antibody | Roche Diagnostics | 11093274910 | |
5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate (BCIP) | Roche Diagnostics | 1383221 | |
4-Nitroblue tetrazolium chloride (NBT) | Roche Diagnostics | 1383213 | |
Proteinase K | Roche Diagnostics | 1092766 | |
Polyethylene molding cup tray | Polysciences | 17177C-3 | |
Vibratome VT1000S | Leica | ||
Confocal microscope Sp5 DM6000 | Leica | ||
Dissecting microscope Nikon SMZ 645 | Nikon | ||
24-well flat bottomed tissue culture plates | Falcon catalog | 353226 | |
Student Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 91150-20 | |
Surgical scissors | Fine Science Tools | 91460-11 | |
Danio rerio Tg(olig2:EGFP) | 24 | ||
Danio rerio WT strains (e.g. AB2O2) |