To shed light on the cellular and molecular mechanisms of zebrafish adult neurogenesis and regeneration, we developed a protocol for invasive surgery causing mechanical injuries in the zebrafish adult telencephalon and subsequent monitoring of changes in the stabbed hemisphere by immunohistochemistry or in situ hybridization.
Volwassen zebravissen hebben een geweldig vermogen om na een blessure hun centrale zenuwstelsel te regenereren. Om de cellulaire respons en de moleculaire mechanismen die betrokken zijn bij de zebravis volwassen centrale zenuwstelsel (CNS) regeneratie en reparatie onderzoeken, ontwikkelden we een zebravis model van volwassen telencephalic letsel.
In deze benadering, we handmatig een blessure te genereren door op een insuline naald in de zebravis volwassen telencephalon. Op verschillende bericht letsel dagen, zijn vis opgeofferd, hun hersenen ontleed uit en gekleurd door immunohistochemie en / of in situ hybridisatie (ISH) met geschikte markers om celproliferatie, gliogenesis en neurogenese observeren. De contralaterale hemisfeer unlesioned dient als een interne controle. Deze methode gecombineerd met bijvoorbeeld RNA deep sequencing kan helpen om het scherm voor nieuwe genen met een rol in de zebravis volwassen telencephalon neurogenese, regeneratie en reparatie.
Zoogdieren hebben een zeer beperkte capaciteit om nieuwe neuronen te genereren op volwassen leeftijd en volwassen neurogenese in de hersenen is grotendeels beperkt tot twee telencephalic gebieden gelegen aan de subventriculaire zone (SVZ) van de laterale ventrikels en de subgranulaire zone (SGZ) van de dentate gyrus in de hippocampus 1. Zoogdieren evenmin letsel aan de hersenen veroorzaakt door neurodegeneratieve ziekten, beroerte of letsel herstellen efficiënt. Verloren neuronen niet vervangen, maar proliferatie van verschillende soorten gliacellen, zoals astrocyten, microglia en oligodendrocyten, waargenomen. Als gevolg van deze proliferatieve proces genaamd reactieve gliosis, wordt de verwonde hersenweefsel afgedicht door de vorming van een gliale litteken, die neuronale en axonale regeneratie 2-4 remt.
In tegenstelling tot zoogdieren, beenvissen, zoals de zebravis vormen nieuwe neuronen overvloedig in volwassen stadia en hebben een hoge regeneratieve en proliferative potentieel letsels van het centrale zenuwstelsel 2,5-7 herstellen. De zebravis volwassen hersenen bevat 16 verschillende neurale stamcellen niches die een groot aantal nieuwe neuronen te genereren gedurende de gehele levensduur 8-11. Neuronen geboren in deze specifieke proliferatie zones van de volwassen hersenen zebravis migreren naar hun doelgebieden, waar ze zullen rijpen en te integreren in de bestaande neuronale netwerken 8,10,12-15.
Onder de voorlopercellen zones die in volwassen zebravissen, de telencephalic ventriculaire zone is een van de meest bestudeerde neuronale stamcellen niches. Cellen in deze voorlopercellen niche kan worden ingedeeld in drie typen betrekking tot hun morfologie, divisie snelheid en expressie van verschillende gliale en neuronale merkers. Type I en type II cellen radiale gliale als cellen die lange processen. Ze drukken stamcellen markers inclusief GFAP, nestine en S100β. Type I cellen niet vermenigvuldigen, terwijl type II cellen proliferate langzaam, zoals blijkt uit hun expressie van proliferatie merkers zoals prolifererende cel nucleair antigen (PCNA) en de toevoeging van desoxythymidine analogen. Het type III cellen zijn snel delende cellen die zich inzetten voor neurale voorlopercellen en expressbedrijf neurale marker-genen, zoals PSA-NCAM 5,16.
Hoewel de regeneratieve capaciteit van beenvissen goed gedocumenteerd zijn, hebben echter slechts enkele publicaties beschreven en in detail onderzocht de cellulaire en moleculaire mechanismen die betrokken zijn bij neuronale regeneratie in de volwassen grote hersenen in antwoord op letsels 15,17-22. Om de mechanismen die betrokken zijn bij de zebravis volwassen centrale zenuwstelsel regeneratie en reparatie ontcijferen en de gelijkenissen en de verschillen tussen constitutieve en regeneratieve neurogenese begrijpen, ontwikkelden we een zebravis model van volwassen telencephalic letsel. Hier beschrijven we visueel hoe een blessure te genereren in een van de telencephalic hemispheres met behulp van een injectienaald, terwijl de contralaterale zijde unlesioned als een interne controle. We zullen zien hoe veranderingen na verwonding in celproliferatie en genexpressie door immunohistochemie en in situ hybridisatie assays volgen.
We beschrijven hier een methode om een telencephalic beschadiging te induceren door op een naald door de schedel van de volwassen zebravissen, en de cellulaire en moleculaire reactie hierop schade door immunohistochemie en in situ hybridisatie analyse. Het belangrijkste voordeel van deze techniek andere bestaande benaderingen zijn eenvoud, snelheid en kostenefficiëntie. Daarom kan deze techniek, die in korte tijd productie van veel gewonden hersenen kan gemakkelijk gecombineerd worden met een grootschalige in situ hybridisatie scherm om genen met een rol in regeneratie en neurogenese.
De leeftijd van de volwassen zebravissen waarop de schade wordt uitgevoerd is van cruciaal belang. Als de vissen ouder dan 1,5 jaar, de schedel te hard en het is mogelijk dat de schedel wordt omlaag geduwd of gebroken in plaats van netjes geperforeerd. In tegenstelling, bij jongere vissen (jonger dan 4 maanden), is er nog veel van neurogenese gaande, die misschien wel lead vals-positieve resultaten met betrekking tot reactief neurogenese.
Een andere belangrijke stap in deze benadering is om de efficiëntie van de steekwond verifiëren en sluiten dat beide hemisferen gewond. Dit kan worden gevolgd door het kleuren van de secties met de anti-PCNA-antilichaam. In een correct ingevoerd laesie moet PCNA aanzienlijk up-gereguleerd in slechts een van de hemisferen.
Het is belangrijk om in gedachten te houden dat de geïnduceerde mechanische verwonding verschillende bijwerkingen zoals niet-specifieke cel ablatie, verhoogde celdood als gevolg van secundaire degeneratie, ontsteking en vernietiging van de bloed-hersenbarrière, en beschadiging van ventriculaire zone en zo zal hebben een mogelijk gevolg stroming van het hersenvocht in de hersenen parenchym. Echter, de gewonde vis lijken weinig last van de blessure. Binnen 2 minuten zijn ze vrij zwemmen weer en normale eetgedrag wordt hersteld binnen ongeveer 4 uur. Na 3 weken injury is morfologisch niet meer zichtbaar. In onze handen, van enkele honderden operaties hebben we niet een enkele vis te verliezen, ondanks het feit dat we een 100% percentage letsels zoals vastgesteld door histologie op 5 dagen na de laesie.
In de laatste jaren andere technieken zoals transgene benaderingen zijn ontwikkeld in zebravis weefsel of celtype specifieke ablatie 2 produceren. Hoewel deze technieken zijn zeer elegant en minimaal invasieve ze zijn gebaseerd op het genereren van complexe DNA-constructen en de instelling van verschillende stabiele transgene zebravis lijnen die zeer vervelend en tijdrovend zijn. Daarom eenvoudige mechanische benaderingen zoals de in dit protocol beschreven assay blijven een belangrijk instrument om volwassen hersenen neurogenese en regeneratie te bestuderen.
The authors have nothing to disclose.
We thank N. Borel and her fish house team, M. Rastegar for help with microscopy, and T. Dickmeis for comments on the manuscript. We are grateful for support by the EU IP ZF-Health, FP7-HEALTH-2007-B2, NeuroXsys, the Interreg Network for Synthetic Biology in the Upper Rhine valley (NSB-Upper Rhine) and the BMBF funded network EraSysBio.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Tricaine | Sigma | 335.2 | |
10x DPBS (-/-) | Life technologies | 14200-083 | |
30 G syringe (Omnican 40) | B.Braun Melsungen | 916162 | |
Polyethylene molding cup tray | Polysciences, Inc | 17177C-3 | |
PeqGOLD Universal Agarose | Peqlab | 35-1020 | |
Bovine serum albumin | Biochrom | W 2835919108 | |
Aqua Poly/Mount | Polysciences, Inc | 18606-20 | |
Tween 20 | Carl Roth | 9127.1 | |
DMSO | Carl Roth | A994.2 | |
Dissection needle | Carl Roth | KX93.1 | |
Paraformaldehyde | Carl Roth | 335.2 | |
Loctite 414 | Schöffler und Wörner | 06 1362 0020 | |
Glass slides | Labonord | 5305103 | |
Cover slips 24 x 60 mm | Labonord | 5305060 | |
Petri dishes 94 mm | Greiner bio-one | 632180 | |
Falcons 15 ml | Greiner bio-one | 188261 | |
24-well plate | Greiner bio-one | 662160 | |
Anti-S100 (1:500) | Dako | Z031101-2 | |
Anti-PCNA (1:400) | Dako | M087901 | |
Anti-GFP (1 :1000) | Aves Labs | GFP-1020 | |
anti-Dig AP-coupled antibody | Roche Diagnostics | 11093274910 | |
5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate (BCIP) | Roche Diagnostics | 1383221 | |
4-Nitroblue tetrazolium chloride (NBT) | Roche Diagnostics | 1383213 | |
Proteinase K | Roche Diagnostics | 1092766 | |
Polyethylene molding cup tray | Polysciences | 17177C-3 | |
Vibratome VT1000S | Leica | ||
Confocal microscope Sp5 DM6000 | Leica | ||
Dissecting microscope Nikon SMZ 645 | Nikon | ||
24-well flat bottomed tissue culture plates | Falcon catalog | 353226 | |
Student Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 91150-20 | |
Surgical scissors | Fine Science Tools | 91460-11 | |
Danio rerio Tg(olig2:EGFP) | 24 | ||
Danio rerio WT strains (e.g. AB2O2) |