To shed light on the cellular and molecular mechanisms of zebrafish adult neurogenesis and regeneration, we developed a protocol for invasive surgery causing mechanical injuries in the zebrafish adult telencephalon and subsequent monitoring of changes in the stabbed hemisphere by immunohistochemistry or in situ hybridization.
Vuxna zebrafisk har en fantastisk förmåga att återskapa sin centrala nervsystemet efter skada. För att undersöka den cellulära svar och de molekylära mekanismer som är inblandade i zebrafisk vuxna centrala nervsystemet (CNS) förnyelse och reparation, vi utvecklat en zebrafisk modell för vuxen telencephalic skada.
I denna strategi, vi genererar en skada manuellt genom att trycka en insulininjektionsnålen i zebrafisk vuxna telencefalon. Vid olika postskade dagar, fisken avlivas, deras hjärnor dissekerades ut och färgades genom immunhistokemi och / eller in situ-hybridisering (ISH) med lämpliga markörer för att observera cellproliferation, gliogenesis och neurogenes. Den kontra unlesioned halvklotet fungerar som en intern kontroll. Denna metod i kombination med t.ex. RNA djupt sekvensering kan hjälpa till skärmen för nya gener med en roll i zebrafisk vuxen telencefalon neurogenesis, förnyelse och reparation.
Däggdjur har en mycket begränsad förmåga att generera nya nervceller under vuxenlivet, och vuxen neurogenes i hjärnan är oftast begränsad till två telencephalic regioner som ligger vid subventrikulära zonen (SVZ) av de laterala ventriklarna, och den subgranular zonen (SGZ) i gyrus gyrus i hippocampus 1. Däggdjur kan inte heller reparera skador i hjärnan orsakad av neurodegenerativa sjukdomar, stroke, eller skador, effektivt. Förlorade neuroner inte ersätts och istället proliferation av olika typer av gliaceller, inklusive astrocyter, mikroglia och oligodendrocyter, observeras. Som en konsekvens av denna proliferativa process kallad reaktiv glios är skadad hjärnvävnad avtätad genom bildning av en glia-ärr, som inhiberar neuronal och axonal återbildning 2-4.
I motsats till däggdjur, teleost fisk som zebrafisk bilda nya nervceller rikligt i vuxenstadier och har en hög regenerativa och proliferative potential för att reparera skador i det centrala nervsystemet 2,5-7. Den zebrafisk vuxna hjärnan innehåller 16 olika neurala stamceller nischer som genererar ett stort antal nya nervceller under hela livet 8-11. Nervceller födda i dessa specifika spridningszoner den vuxna zebrafisk hjärnan migrera till målområdena, där de kommer att mogna och integreras i de befintliga neuronala nätverk 8,10,12-15.
Bland prekursorcellerna zoner som identifierats i vuxen zebrafisk, är det telencephalic kammarzonen en av de mest studerade neuronala stamceller nischer. Celler i denna stamfader nisch kan delas in i tre olika typer om deras morfologi, division hastighet och uttryck av olika gliaceller eller neuronala markörer. Typ I och typ II-celler är radiella gliaceller liknande celler som har långa processer. De uttrycker stamceller markörer inklusive GFAP, nestin och S100β. Typ I cellerna inte föröka sig medan typ II-celler proliferate långsamt, vilket framgår av deras uttryck av proliferationsmarkörer såsom prolifererande cellkärnantigen (PCNA) och införlivandet av desoxythymidine analoger. Typ III cellerna snabbt delande celler som har åtagit sig att bli neurala stamceller och uttrycka neurala markörgener, såsom PSA-NCAM 5,16.
Även de regenerativa kapacitet teleost fisk är väl dokumenterade, har bara några publikationer beskrivs och undersöks i detalj de cellulära och molekylära mekanismer som är involverade i neuronal regeneration i den vuxna telencefalon som svar på skada 15,17-22. För att dechiffrera de mekanismer som är inblandade i zebrafisk vuxna centrala nervsystemet förnyelse och reparation och för att förstå likheter och skillnader mellan konstitutiva och regenerativ neurogenes, vi utvecklat en zebrafisk modell för vuxen telencephalic skada. Här kommer vi att beskriva visuellt hur man skapar en skada i en av de telencephalic hemispheres med hjälp av en sprutnål, medan det kontralate unlesioned sidan som en intern kontroll. Vi kommer också att visa hur man kan övervaka förändringar vid skador i celltillväxt och genuttryck genom immunhistokemi och in situ hybridisering analyser.
Vi beskriver här en metod för att inducera en telencephalic skada genom att trycka på en nål genom skallen av den vuxna zebrafisk, och att analysera cellulär och molekylär reaktion på denna skada genom immunhistokemi och hybridisering in situ. Den största fördelen med denna teknik jämfört med andra existerande tillvägagångssätt är dess enkelhet, snabbhet och kostnadseffektivitet. Därför kan denna teknik, som möjliggör produktion av många skadade hjärnor på en kort tid, enkelt kombineras med en storskalig in situ hybridisering skärmen för att identifiera gener med en roll i regenerering och neurogenes.
Åldern på den vuxna zebrafisk på vilken skade utförs är avgörande. Om fisken är äldre än 1,5 år, är skallen för hårt och det är möjligt att skallen skjuts ned eller slås sönder snarare än rent perforerad. Däremot i yngre fisk (yngre än 4 månader), finns det fortfarande en hel del neurogenes händer, som kanske lead till falskt positiva resultat när det gäller reaktiv neurogenes.
Ett annat kritiskt steg i denna metod är att kontrollera effektiviteten av sticksår och för att utesluta att båda hemisfärerna är skadade. Detta kan övervakas genom färgning av sektionerna med anti-PCNA-antikropp. I en korrekt infört lesion bör PCNA vara betydligt uppregleras i endast en av hjärnhalvorna.
Det är viktigt att ha i åtanke att den inducerade mekanisk skada kommer att ha flera biverkningar såsom icke-specifik cell ablation, ökad celldöd på grund av sekundär degeneration, inflammation och destruktion av blod-hjärnbarriären, och skada på ventrikulära zonen och som en möjlig konsekvens flöde av cerebrospinalvätskan i hjärnparenkymet. Men de skadade fisken verkar lida mycket lite från skadan. Inom 2 min de är fria simning igen och normalt ätbeteende återställs inom ungefär 4 timmar. Efter 3 veckor i ig skada är morfologiskt inte syns längre. I våra händer, från flera hundra operationer vi inte förlora en enda fisk, trots att vi hade en 100% skada takt som bedöms av histologi vid 5 dagar efter lesion.
Under de senaste åren andra tekniker såsom transgena metoder har utvecklats i zebrafisk för att producera vävnad eller celltyp specifika ablation 2. Även om dessa tekniker är mycket elegant och minimalt invasiv de är baserade på generering av komplicerade DNA-konstruktioner och inrättandet av flera stabila zebrafisk transgena linjer som kan vara mycket tröttande och tidskrävande. Därför enkla mekaniska metoder såsom den analys som beskrivs i detta protokoll förblir ett viktigt verktyg för att studera vuxna hjärnan neurogenes och förnyelse.
The authors have nothing to disclose.
We thank N. Borel and her fish house team, M. Rastegar for help with microscopy, and T. Dickmeis for comments on the manuscript. We are grateful for support by the EU IP ZF-Health, FP7-HEALTH-2007-B2, NeuroXsys, the Interreg Network for Synthetic Biology in the Upper Rhine valley (NSB-Upper Rhine) and the BMBF funded network EraSysBio.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Tricaine | Sigma | 335.2 | |
10x DPBS (-/-) | Life technologies | 14200-083 | |
30 G syringe (Omnican 40) | B.Braun Melsungen | 916162 | |
Polyethylene molding cup tray | Polysciences, Inc | 17177C-3 | |
PeqGOLD Universal Agarose | Peqlab | 35-1020 | |
Bovine serum albumin | Biochrom | W 2835919108 | |
Aqua Poly/Mount | Polysciences, Inc | 18606-20 | |
Tween 20 | Carl Roth | 9127.1 | |
DMSO | Carl Roth | A994.2 | |
Dissection needle | Carl Roth | KX93.1 | |
Paraformaldehyde | Carl Roth | 335.2 | |
Loctite 414 | Schöffler und Wörner | 06 1362 0020 | |
Glass slides | Labonord | 5305103 | |
Cover slips 24 x 60 mm | Labonord | 5305060 | |
Petri dishes 94 mm | Greiner bio-one | 632180 | |
Falcons 15 ml | Greiner bio-one | 188261 | |
24-well plate | Greiner bio-one | 662160 | |
Anti-S100 (1:500) | Dako | Z031101-2 | |
Anti-PCNA (1:400) | Dako | M087901 | |
Anti-GFP (1 :1000) | Aves Labs | GFP-1020 | |
anti-Dig AP-coupled antibody | Roche Diagnostics | 11093274910 | |
5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate (BCIP) | Roche Diagnostics | 1383221 | |
4-Nitroblue tetrazolium chloride (NBT) | Roche Diagnostics | 1383213 | |
Proteinase K | Roche Diagnostics | 1092766 | |
Polyethylene molding cup tray | Polysciences | 17177C-3 | |
Vibratome VT1000S | Leica | ||
Confocal microscope Sp5 DM6000 | Leica | ||
Dissecting microscope Nikon SMZ 645 | Nikon | ||
24-well flat bottomed tissue culture plates | Falcon catalog | 353226 | |
Student Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 91150-20 | |
Surgical scissors | Fine Science Tools | 91460-11 | |
Danio rerio Tg(olig2:EGFP) | 24 | ||
Danio rerio WT strains (e.g. AB2O2) |