To shed light on the cellular and molecular mechanisms of zebrafish adult neurogenesis and regeneration, we developed a protocol for invasive surgery causing mechanical injuries in the zebrafish adult telencephalon and subsequent monitoring of changes in the stabbed hemisphere by immunohistochemistry or in situ hybridization.
Voksen sebrafisk har en utrolig evne til å regenerere sin sentrale nervesystemet etter skade. For å undersøke cellulær respons og de molekylære mekanismene som er involvert i sebrafisk voksne sentralnervesystemet (CNS) regenerering og reparasjon, utviklet vi en sebrafisk-modellen av voksen telencephalic skade.
I denne tilnærmingen, vi generere en skade manuelt ved å skyve en insulinsprøyte nål inn i sebrafisk voksen telencephalon. På forskjellige innlegg skade dager, er fisken avlivet, hjernen dissekeres ut og farget ved immunhistokjemi og / eller in situ hybridisering (ISH) med hensiktsmessige markører for å observere celleproliferasjon, gliogenesis og neurogenesis. Kontralaterale unlesioned halvkule fungerer som en intern kontroll. Denne metoden kombinert for eksempel med RNA dyp sekvensering kan bidra til skjermen for nye gener med en rolle i sebrafisk voksen telencephalon neurogenesis, gjenfødelse, og reparasjon.
Pattedyr har en svært begrenset kapasitet til å generere nye nerveceller i voksen alder, og voksen neurogenesis i hjernen er stort sett begrenset til to telencephalic regioner som ligger på subventricular sone (SVZ) av den laterale ventriklene, og den subgranular sone (SGZ) av dentate gyrus i hippocampus en. Pattedyr kan heller ikke reparere skader i hjernen forårsaket av neurodegenerative sykdommer, slag, eller skade, effektivt. Mistet nevroner blir ikke erstattet, og i stedet spredning av ulike typer av gliaceller, inkludert astrocytter, microglia og oligodendrocytes, er observert. Som en konsekvens av denne proliferative prosess kalt reaktive gliosis blir skadet hjernevev tettet ved dannelse av en glial arr, som hemmer nevronal og aksonal regenerering 2-4.
I motsetning til pattedyr, beinfisk som sebrafisk danne nye nerveceller i overflod hos voksne stadier og har en høy regenererende og proliferative potensial for å reparere lesjoner i sentralnervesystemet 2,5-7. Sebrafisk voksne hjernen inneholder 16 forskjellige nevrale stamceller nisjer som genererer et stort antall nye nevroner i løpet av hele livet 8-11. Nevroner født i disse spesifikke spredningssonene av den voksne sebrafisk hjernen migrere til sine satsingsområder, hvor de vil modnes og integreres i de eksisterende nevrale nettverk 8,10,12-15.
Blant de progenitor soner identifisert i voksne sebrafisk, er telencephalic ventrikulær sone en av de mest studerte nevrale stamceller nisjer. Celler i denne stamfar nisje kan klassifiseres i tre forskjellige typer om deres morfologi, divisjon rate og uttrykk av forskjellige glial eller nevronale markører. Type I-og type II cellene er radial glial lignende celler som har lange prosesser. De uttrykker stamceller markører inkludert GFAP, nestin, og S100β. Type I celler ikke sprer mens type II celler proliferate sakte, som vist ved deres ekspresjon av sprednings markører som prolifererende celleatom antigen (PCNA), og inkorporering av desoxythymidine analoger. Den type III cellene er raskt dele celler som er forpliktet til å bli nevrale stamceller og uttrykke nevrale markørgener, slik som PSA-NCAM 5,16.
Selv om de regenerative kapasiteter teleost fish er godt dokumentert, er det bare noen få publikasjoner som er beskrevet og undersøkt i detalj de cellulære og molekylære mekanismer som er involvert i neuronal regenerering i den voksne telencephalon i respons til skade 15,17-22. Å dechiffrere mekanismene innblandet i sebrafisk voksne sentralnervesystemet regenerering og reparasjon og å forstå likheter og forskjeller mellom konstituerende og regenerativ neurogenesis, utviklet vi en sebrafisk-modellen av voksen telencephalic skade. Her vil vi beskrive hvordan visuelt å generere en skade på en av de telencephalic hemispheres ved hjelp av en sprøyte nål, mens du holder den kontralaterale unlesioned side som en intern kontroll. Vi vil også vise hvordan å overvåke endringer ved skade i celleproliferasjon og genuttrykk ved immunhistokjemi og in situ hybridisering analyser.
Vi beskriver her en metode for å indusere en telencephalic skade ved å dytte en nål gjennom hodeskallen av den voksne sebrafisk, og å analysere cellulært og molekylært reaksjon på denne skaden ved immunhistokjemi og in situ hybridisering. Den største fordelen med denne teknikken i forhold til andre eksisterende tilnærminger er dens enkelhet, hastighet og kostnadseffektivitet. Derfor kan denne teknikk, som gjør det mulig for produksjon av mange skadede hoder i en kort tid, lett kan kombineres med en stor skala in situ hybridisering skjermen for å identifisere gener med en rolle for regenerering og neurogenesis.
Alderen på den voksne sebrafisk som skaden er utført er avgjørende. Hvis fisken er eldre enn 1,5 år, er skallen for hardt, og det er mulig at skallen skyves ned eller brukket i stedet for ren perforert. I kontrast, i yngre fisk (yngre enn 4 måneder), er det fortsatt mye neurogenesis skjer, som kan lead til falske positive resultater om reaktiv neurogenesis.
Et annet kritisk punkt i denne tilnærmingen er å verifisere effektiviteten av stikk sår og for å utelukke at begge halvkuler er såret. Dette kan overvåkes ved farging seksjonene med anti-PCNA-antistoff. I en korrekt innført lesjon, bør PCNA være vesentlig oppregulert i bare ett av de halvkuler.
Det er viktig å huske på at den induserte mekanisk skade vil ha flere bivirkninger som uspesifikke celle ablasjon, økt celledød på grunn av sekundær degenerasjon, betennelse og ødeleggelse av blod-hjerne barrieren, og skader av ventrikkel-sonen og som en mulig konsekvens strømning av spinalvæsken inn i hjernen parenchyma. Men de skadede fisk synes å lide svært lite fra skaden. Innen to minutter er de gratis svømming igjen og normal fôring atferd er gjenopprettet innen ca 4 timer. Etter tre uker på injury er morfologisk ikke synlig lenger. I våre hender, fra flere hundre operasjoner vi ikke miste en eneste fisk til tross for at vi hadde en 100% skadefrekvens som vurderes av histologi på fem dager etter lesjon.
I de siste årene andre teknikker slik som transgene metoder er blitt utviklet i sebrafisk for å produsere vev-eller celletype spesifikk ablasjon 2. Selv om disse teknikkene er svært elegant og minimalt invasiv de er basert på generering av kompliserte DNA-konstruksjoner og etablering av flere stabile sebrafisk transgene linjer som kan være veldig kjedelig og tidkrevende. Derfor enkle mekaniske tilnærminger som analysen beskrevet i denne protokollen er fortsatt et viktig verktøy for å studere voksne hjernen neurogenesis og regenerering.
The authors have nothing to disclose.
We thank N. Borel and her fish house team, M. Rastegar for help with microscopy, and T. Dickmeis for comments on the manuscript. We are grateful for support by the EU IP ZF-Health, FP7-HEALTH-2007-B2, NeuroXsys, the Interreg Network for Synthetic Biology in the Upper Rhine valley (NSB-Upper Rhine) and the BMBF funded network EraSysBio.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Tricaine | Sigma | 335.2 | |
10x DPBS (-/-) | Life technologies | 14200-083 | |
30 G syringe (Omnican 40) | B.Braun Melsungen | 916162 | |
Polyethylene molding cup tray | Polysciences, Inc | 17177C-3 | |
PeqGOLD Universal Agarose | Peqlab | 35-1020 | |
Bovine serum albumin | Biochrom | W 2835919108 | |
Aqua Poly/Mount | Polysciences, Inc | 18606-20 | |
Tween 20 | Carl Roth | 9127.1 | |
DMSO | Carl Roth | A994.2 | |
Dissection needle | Carl Roth | KX93.1 | |
Paraformaldehyde | Carl Roth | 335.2 | |
Loctite 414 | Schöffler und Wörner | 06 1362 0020 | |
Glass slides | Labonord | 5305103 | |
Cover slips 24 x 60 mm | Labonord | 5305060 | |
Petri dishes 94 mm | Greiner bio-one | 632180 | |
Falcons 15 ml | Greiner bio-one | 188261 | |
24-well plate | Greiner bio-one | 662160 | |
Anti-S100 (1:500) | Dako | Z031101-2 | |
Anti-PCNA (1:400) | Dako | M087901 | |
Anti-GFP (1 :1000) | Aves Labs | GFP-1020 | |
anti-Dig AP-coupled antibody | Roche Diagnostics | 11093274910 | |
5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate (BCIP) | Roche Diagnostics | 1383221 | |
4-Nitroblue tetrazolium chloride (NBT) | Roche Diagnostics | 1383213 | |
Proteinase K | Roche Diagnostics | 1092766 | |
Polyethylene molding cup tray | Polysciences | 17177C-3 | |
Vibratome VT1000S | Leica | ||
Confocal microscope Sp5 DM6000 | Leica | ||
Dissecting microscope Nikon SMZ 645 | Nikon | ||
24-well flat bottomed tissue culture plates | Falcon catalog | 353226 | |
Student Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 91150-20 | |
Surgical scissors | Fine Science Tools | 91460-11 | |
Danio rerio Tg(olig2:EGFP) | 24 | ||
Danio rerio WT strains (e.g. AB2O2) |