מדידת תפקודי נשימה בעכברים באמצעות Plethysmography של כל הגוף ללא ריסון
Summary
ההערכה של פיזיולוגיה נשימה הסתמכה באופן מסורתי על טכניקות, הדורשות איפוק או הרגעה של בעלי החיים. plethysmography כל הגוף בלתי מרוסן, לעומת זאת, מספק ניתוח מדויק, לא פולשנית, כמותי של פיזיולוגיה נשימה במודלים של בעלי חיים. בנוסף, הטכניקה מאפשרת חוזרת ונשנית בדרכי הנשימה הערכה של עכברים המאפשרים למחקרים ארוכים טווח.
Abstract
תפקוד לקוי של נשימה הוא אחד הגורמים המובילים לתחלואה ותמותה בעולם ושיעורי התמותה ממשיכים לעלות. הערכה כמותית של תפקוד ריאות במודלים של מכרסמים היא כלי חשוב בפיתוח טיפולים עתידיים. בדרך כלל השתמש בטכניקות להערכת תפקוד מערכת הנשימה כולל plethysmography פולשנית ותנודה בכפייה. בעוד טכניקות אלה מספקים מידע רב ערך, איסוף הנתונים יכול להיות כרוך עם חפצים והשתנות ניסיונית בשל הצורך בהרדמה ו / או מכשור פולשני של בעלי החיים. בניגוד לכך, plethysmography בלתי מרוסן של כל הגוף (UWBP) מציע דרך מדויקת, לא פולשנית, כמותי, שעל ידי ניתוח פרמטרים בדרכי הנשימה. טכניקה זו תמנע את השימוש בהרדמה ומעצורים, המשותף לטכניקות plethysmography מסורתיות. וידאו זה מדגים את הליך UWBP כולל הציוד להגדיר הקלטת פונקצית כיול וריאות,. זהיסביר כיצד לנתח את הנתונים שנאספו, כמו גם לזהות את חריגים ניסיוניים וחפצים, הנובע מתנועה של בעלי החיים. הפרמטרים הנשימה שהושגו באמצעות טכניקה זו כוללים נפח של גאות ושפל, נפח דקה, מחזור עבודת שאיפה, קצב זרימת שאיפה ויחס של זמן השראה לזמן תפוגה. UWBP אינו מסתמך על כישורים מיוחדים והוא זול לביצוע. תכונה מרכזית של UWBP, ומושכת ביותר למשתמשים פוטנציאליים, היא היכולת לבצע מדידות חוזרות של תפקוד ריאות באותו בעל חיים.
Introduction
תפקוד לקוי של ריאות הוא אחד הגורמים המובילים לתחלואה ותמותה בעולם. המצב מאופיין בחילופי חמצן לקויים, לשם נרדפים לשיעול, כאבים בחזה וקוצר נשימה. חשבונות מחלה בדרכי הנשימה ל~ 10% מהתמותה בעולם 1. על פי ארגון הבריאות העולמי, שיעורי תמותה נקבעים לעלות עקב עישון מתמשך, זיהום וחומרים מגרים בעיסוק. UWBP היא תוספת שימושית לחקר פיזיולוגיה של ריאות, אשר מאוד מחמאות ביוכימיים מסורתיים והיסטולוגית מנתח 2. נהלים אחרים המשמשים להערכת ריאות אינם מספקים את אותם יתרונות שUWBP. plethysmography פולשנית היא טכניקה נפוץ הדורשת את בעל החיים לanesthetised 3,4 ובכך, מדידות בדרכי הנשימה וכתוצאה מכך אינן בהכרח משקפות את מצב טבעי. יתר על כן, הדרישה לאתגרי אוורור וכימי מכאניים מונעת מדידות עתיד 3,4.שיטה נוספת של איסוף נתונים בדרכי הנשימה היא על ידי תנודה בכפייה, שהוא יותר רגיש למעודן שינויים בפרמטרים בדרכי הנשימה בהשוואה לUWBP 5. תנודת כפייה היא, עם זאת, טכניקה פולשנית ודורשת הפסקה של בעלי חיים לאיסוף נתונים 5-7.
UWBP כולל הצבת בעלי חיים בתוך תא מיוחד. במהלך השראה, האוויר של גאות ושפל הוא חימם וhumidified בתוך ריאות הגדלת לחץ אדי מים וגורם להתפשטות תרמית של גז 8. אפקט זה גורם לשינוי נטו בנפח אוויר יצירת עלייה בלחץ בתוך תא plethysmograph 8. ההפך מתרחש במהלך פקיעת יצירת צורת גל נשימה מהחיה. ניתוח צורת גל לאחר מכן נעשה שימוש כדי למדוד מעקבות נשימה: קצב נשימה (נשימות / דקה), סך הכל זמן מחזור הנשימה (שניות), השראה / זמן תפוגה (Ti / טה, שניות) ושינויים בלחץ בשל כל כרך של גאות ושפל (P T). <strong> איור 1 מדגים כל מוצא מדידות מעקבות נשימה. מדידות אלה הן פשוט לחישוב ופרמטרי נשימה מרובים עשויים להיגזר ממדידות אלה. פרמטרים אלה כוללים: נפח Tidal (נפח האוויר נע בין שאיפה ונשיפה הרגילות), נפח דקות (נפח של גז בשאיפה מהריאות לדקה), מחזור עבודת שאיפה (אחוז זמן השראה לסך משך מחזור הנשימה) ו קצב זרימת שאיפה (כמות האוויר בהשראה בזמן נתון).
UWBP מספק ניתוח מדויק, לא פולשנית, כמותי של פיזיולוגיה נשימה במודלים של בעלי חיים והוא יכול לשמש למדידת ההתקדמות של מחלה בדרכי הנשימה ו6,9 תפקוד ריאות. בניגוד לטכניקות plethysmography אחרות, UWBP ימנע את השימוש בהרדמה, מעצורים ומניפולציות פולשנית המייצרות חפצים ו6,9 השתנות ניסיוניים. הרדמה יכולה לדכא נשימה,לשנות את קצב לב ויכול להיות מאתגר להסדיר 10. מגבלות לגרום לעלייה בנשימה עקב מתח נוסף באמצעות corticosterone ואפינפרין לשחרר 11,13. התכונה המרכזית של UWBP חוזרת על עצמו הערכה פיזיולוגית שהופכת אותו נוח למחקרים ארוכים טווח. UWBP מומלץ מאוד להערכת האורך של פיזיולוגיה ריאות ומציעה מיומנות חשובה להערכת תרופה בדרכי הנשימה בעתיד.
בלאומיצין, ovalbumin, והיפוקסיה כבר נוצלו כדי לגרום לאתגרים בדרכי הנשימה במספר מחקרים וUWBP מודד את ההערכה פיזיולוגית ריאות מדויקות 7,9,13-16 בהצלחה. הפרוטוקול המתואר מיועד לעכברי מעבדה מבוגר סטנדרטיים. עם זאת, UWBP הותאם לבעלי חיים אחרים כגון חולדות, חזירי ים, ופרימטים שאינם בני אדם 17-20. UWBP אינו מוגבל רק להערכת תפקוד ריאתי, אך שימש גם להערכת ריאות התבגרות 3.צדדיות, הפשטות והשחזור של UWBP הקימו טכניקה מצוינת להערכת תפקוד הריאתי בבעלי חיים. תוכנה שונות (ראה חומרים ושולחן ציוד) תידרש לבצע הליך זה. מדען מנוסה יהיה מסוגל לבצע פרוטוקול זה עם עכבר בתוך שעה 1.
Protocol
Representative Results
Discussion
הטכניקה המתוארת כאן היא שיטה לא פולשנית להערכה של פרמטרים בדרכי הנשימה של עכברים חסרי מעצורים וunanesthetized. נקודות החוזק של פרוטוקול זה כולל פשטות שלו ודיוק כדי למדוד את תפקוד ריאות אורכים עם חפצים מינימאליים. יש, עם זאת, יש מספר מגבלות וצעדים קריטיים ללציין על ההליך. ראש…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We would like to thank Prof David Walker for his technical advice and provision of equipment in the development of this technique. This work is supported by the Victorian Government’s Operational Infrastructure Support Program. This work was partly supported by the Victorian Government’s Operational Infrastructure Support Program.
Materials
| LabChart 7 software (for Macintosh) | ADINSTRUMENTS | MLU60/7 | used in protocol step 4 |
| PowerLab 8/30 (model ML870) | ADINSTRUMENTS | PL3508 | |
| Octal Bridge Amp (model ML228) | ADINSTRUMENTS | FE228 | |
| Black BNC to BNC cable (1m) | ADINSTRUMENTS | MLAC01 | |
| Macintosh OS | Apple Inc. | – | Mac OS X 10.4 or later |
| Surgipack Digital Rectal Thermometer | Vega Technologies | MT-918 | |
| Grass volumeteric pressure transducer PT5A | Grass Instruments Co. | Model number PT5A; serial No. L302P4. | |
| 1ml Syringe | Becton Dickinson (BD) | 309628 | |
| 5ml serological syringe pipettes | Greiner Bio One | 606160 | Connected via plastic tubing |
| Balance/Scales | VWR International, Pty Ltd | SHIMAUW220D | Any weighing balance with of 0.1 gram resolution |
| HM40 Humidity & temperature meter | Vaisala | HM40A1AB | |
| Barometer | Barometer World | 1586 | |
| Laboratory tubing | Dow Corning | 508-101 | Used to connect water column to the syringe and pressure transducer |
| Cylindrical Perspex Chamber | Dynalab Corp. | Custom built cylindrical chamber with internal dimensions as follows: 50mm(w) x 1500mm(l). There are two lids for each side, with dimensions 80mm(l) x 80mm(w). Each lid has a 60mm wide circular hole cut on the face of the lid 50mm deep. This allows the chamber to fit into the lid. A rubber ring is fitted around each hole of the lid where the chamber will fit. For attachment of syringe and pressure transducer, the openings are 5mm in diameter. For attachment of humidity probe, the openings are 25mm in diameter. | |
| 80% Ethanol (4L) | VWR International, Pty Ltd | BDH1162-4LP |
References
- . . World Health Organization, World Health Statistics. , (2008).
- Jones, C. V., et al. M2 macrophage polarization is associated with alveolar formation during postnatal lung development. Respir. Res. 14 (41), 14-41 (2013).
- Campbell, E., et al. Stem cell factor-induced airway hyperreactivity in allergic and normal mice. Am. J. Pathol. 154 (4), 1259-1265 (1999).
- Card, J. W., et al. Cyclooxygenase-2 deficiency exacerbates bleomycin-induced lung dysfunction but not fibrosis. Am. J. Respir. Cell. Mol. Biol. 37 (3), 300-308 (2007).
- Berndt, A., et al. Comparison of unrestrained plethysmography and forced oscillation for identifying genetic variability of airway responsiveness in inbred mice. Physiol. Genomics. 43 (1), 1-11 (2011).
- Flandre, T., et al. Effect of somatic growth, strain, and sex on double-chamber plethysmographic respiratory function values in healthy mice. J. Appl. Physiol. 94 (3), 1129-1136 (2003).
- Petak, F., et al. Hyperoxia-induced changes in mouse lung mechanics: forced oscillations vs. barometric plethysmography. J. Appl. Physiol. 90 (6), 2221-2230 (2001).
- Drorbaugh, J. E., Fenn, W. O. A barometric method for measuring ventilation in newborn infants. Pediatrics. 16 (1), 81-87 (1955).
- Milton, P. L., Dickinson, H., Jenkin, G., Lim, R. Assessment of respiratory physiology of C57BL/6 mice following bleomycin administration using barometric plethysmography. Respiration. 83 (3), 253-266 (2012).
- Gargiulo, S., et al. Mice anesthesia, analgesia, and care, part I: anesthetic considerations in preclinical research. ILAR J. 53 (1), 55-69 (2012).
- Hildebrandt, I., et al. Anesthesia and other considerations for in vivo imaging of small animals. ILAR J. 49 (1), 17-26 (2008).
- Meijer, M. K., et al. Effect of restraint and injection methods on heart rate and body temperature in mice. Lab Anim. 40, 382-391 (2006).
- Hamelmann, E., et al. Noninvasive measurement of airway responsiveness in allergic mice using barometric plethysmography. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 156 (3), 766-775 (1997).
- Lim, R., et al. Human mesenchymal stem cells reduce lung injury in immunocompromised mice but not in immunocompetent mice. Respiration. 85 (4), 332-341 (2013).
- Murphy, S., et al. Human amnion epithelial cells prevent Bleomycin-induced lung injury and preserve lung function. Cell Transplant. 20, 909-923 (2011).
- Murphy, S., et al. Human amnion epithelial cells do not abrogate pulmonary fibrosis in mice with impaired macrophage function. Cell Transplant. 21 (7), 1477-1492 (2012).
- Wichers, L. B., et al. A method for exposing rodents to resuspended particles using whole-body plethysmography. Part. Fibre Toxicol. 13 (12), (2006).
- Chong, B. T. Y., et al. Measurement of bronchoconstriction using whole-body plethysmograph: comparison of freely moving versus restrained guinea pigs. J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 39 (3), 163-168 (1998).
- Lizuka, H., et al. Measurement of respiratory function using whole-body plethysmography in unanesthetized and unrestrained nonhuman primates. J. Toxicol. Sci. 35 (6), 863-870 (2010).
- McGregor, H., et al. The effect of prenatal exposure to carbon monoxide on breathing and growth of the newborn guinea pig. Pediatr. Res. 43, 126-131 (1998).
- Lundblad, L., et al. A reevaluation of the validity of unrestrained plethysmography in mice. J. Appl. Physiol. 93, 1198-1207 (2002).
- Bartlett, D., Tenney, S. M. Control of breathing in experimental anemia. Respir. Physiol. 10 (3), 384-395 (1970).
- Malan, A. Ventilation measured by body plethysmography in hibernating mammals and in poiiulotherms. Respir. Physiol. 17 (1), 32-44 (1973).
- Seifert, E. L., Mortola, J. P. The circadian pattern of breathing in conscious adult rats. Respir. Physiol. 129 (3), 297-305 (2002).
- DuBois, A. B., et al. A new method for measuring airway resistance in man using a body plethysmograph: Values in normal subject and in patients with respiratory disease. J. Clin. Invest. 35 (3), 327-335 (1956).
- Enhorning, G., et al. Whole-body plethysmography, does it measure tidal volume of small animals. Can. J. Physiol. Pharmacol. 76 (10-11), 945-951 (1998).
- Zhang, Q., et al. Does unrestrained single-chamber plethysmography provide a valid assessment of airway responsiveness in allergic BALB/c mice. Respir. Res. 10 (61), (2009).
