Medición de la función respiratoria en ratones usando irrestricta pletismografía corporal total

Summary

La evaluación de la fisiología respiratoria se ha basado tradicionalmente en las técnicas, que requieran inmovilización o sedación de los animales. Unrestrained pletismografía de cuerpo entero, sin embargo, proporciona un análisis cuantitativo preciso, no invasivo, de la fisiología respiratoria en modelos animales. Además, la técnica permite repitió evaluación respiratorio de los ratones que permiten estudios longitudinales.

Abstract

La disfunción respiratoria es una de las principales causas de morbilidad y mortalidad en el mundo y las tasas de mortalidad siguen aumentando. La evaluación cuantitativa de la función pulmonar en modelos de roedores es una herramienta importante en el desarrollo de futuras terapias. Comúnmente utilizado técnicas para la evaluación de la función respiratoria incluyendo pletismografía invasiva y oscilación forzada. Si bien estas técnicas proporcionan información valiosa, la recopilación de datos puede estar lleno de artefactos y la variabilidad experimental debido a la necesidad de anestesia y / o instrumentación invasiva del animal. En contraste, sin restricciones pletismografía de cuerpo entero (UWBP) ofrece una manera precisa, no invasiva, por el cual cuantitativa para analizar los parámetros respiratorios. Esta técnica evita el uso de anestesia y restricciones, que es común a las técnicas tradicionales de pletismografía. Este video demostrará el procedimiento UWBP incluido el equipo instalado, calibrado y pulmón grabación función. Esexplicará la forma de analizar los datos recogidos, así como identificar valores atípicos experimentales y artefactos que resulta de la circulación de animales. Los parámetros respiratorios obtenidos utilizando esta técnica incluyen el volumen corriente, el volumen minuto, ciclo de trabajo inspiratorio, velocidad de flujo inspiratorio y la proporción de tiempo de inspiración a tiempo de caducidad. UWBP no se basa en conocimientos especializados y es de bajo costo para llevar a cabo. Una característica clave de UWBP, y más atractivo para los usuarios potenciales, es la capacidad de realizar mediciones repetidas de la función pulmonar en el mismo animal.

Introduction

Disfunción de pulmón es una de las principales causas de morbilidad y mortalidad en el mundo. La condición se caracteriza por el intercambio de oxígeno insuficiente, sinónimo de tos, dolores en el pecho y la disnea. La enfermedad respiratoria para ~ 10% de la mortalidad en todo el mundo ^1. Según la Organización Mundial de la Salud, las tasas de mortalidad se prevé un aumento a causa del tabaquismo persistente, la contaminación y los irritantes ocupacionales. UWBP es una adición útil para el estudio de la fisiología pulmonar, que complementa fuertemente bioquímica tradicional y análisis histológicos ^2. Otros procedimientos utilizados para la evaluación de pulmón no ofrecen las mismas ventajas que UWBP. Pletismografía invasiva es una técnica de uso común que requiere que el animal sea anestesiado ^3,4 y por lo tanto, las mediciones respiratorias resultantes no son necesariamente un reflejo de un estado natural. Además, el requisito de ventilación y químicas desafíos mecánicos excluye futuras mediciones ^3,4.Otro método de recogida de datos respiratoria es por oscilación forzada, que es más sensible a cambios en los parámetros más finas respiratorias en comparación con UWBP ^5. Oscilación forzada es, sin embargo, una técnica invasiva y requiere la terminación de animales para la recogida de datos ^5-7.

UWBP consiste en colocar un animal dentro de una cámara especializada. Durante la inspiración, el aire se calienta de marea y humidificado dentro de los pulmones aumento de presión de vapor de agua y provoca la expansión térmica de gas ^8. Este efecto provoca un cambio neto en el volumen de aire de la creación de un aumento de la presión dentro de la cámara ⁸ pletismógrafo. Lo contrario ocurre durante la espiración la creación de una forma de onda respiratoria del animal. Análisis de forma de onda se utiliza para medir desde la traza respiratoria: frecuencia respiratoria (respiraciones / min), el tiempo total del ciclo respiratorio (seg), la inspiración / tiempo de expiración (Ti / Te, seg) y cambios en la presión debido a cada volumen corriente (P _T). <strong> Figura 1 ilustra cada origen mediciones de una traza respiratorio. Estas mediciones son simples y múltiples para calcular los parámetros respiratorios se pueden derivar de estas mediciones. Estos parámetros incluyen: El volumen corriente (volumen de aire movido entre la inhalación y la exhalación normales), el volumen minuto (volumen de gas inhalado desde los pulmones por minuto), ciclo de trabajo de inspiración (el porcentaje de tiempo de inspiración a la duración total del ciclo de respiración) y velocidad de flujo inspiratorio (la cantidad de aire inspirado en un tiempo dado).

UWBP proporciona un análisis cuantitativo preciso, no invasivo, de la fisiología respiratoria en modelos animales y se puede utilizar para medir la progresión de la enfermedad respiratoria y la función pulmonar ^6,9. Contrariamente a otras técnicas de pletismografía, UWBP evita el uso de la anestesia, las restricciones y las manipulaciones invasivas que producen artefactos y la variabilidad experimental ^6,9. La anestesia puede suprimir la respiración,alterar el ritmo cardíaco y puede ser un reto para regular ^10. Las restricciones inducen un aumento en la respiración debido a la tensión adicional a través de la corticosterona y la epinefrina liberan ^11,13. La característica clave de UWBP se repite evaluación fisiológica por lo que es susceptible de estudios longitudinales. UWBP es muy recomendable para la evaluación longitudinal de la fisiología pulmonar y ofrece una habilidad valiosa para la futura evaluación de drogas respiratoria.

Bleomicina, ovoalbúmina, y la hipoxia se han utilizado para inducir desafíos respiratorios en varios estudios y UWBP ha medido correctamente pulmón precisa evaluación fisiológica ^7,9,13-16. El protocolo descrito está diseñado para ratones de laboratorio estándar adulto. Sin embargo, UWBP ha sido adaptado a otros animales tales como ratas, cobayas, y primates no humanos ^17-20. UWBP no se limita únicamente a la evaluación de la disfunción pulmonar, pero también se ha utilizado para la evaluación de la maduración pulmonar ^3.La versatilidad, la sencillez y reproducibilidad de UWBP han establecido una técnica excelente para la evaluación de la función pulmonar en los animales. Varios software (ver materiales y equipos de la tabla) se requerirá seguir este procedimiento. Un científico experimentado sería capaz de realizar este protocolo con un ratón dentro de 1 hr.

Protocol

NOTA: El siguiente procedimiento experimental es aprobado por el Comité de Ética Animal de la Universidad de Monash y llevó a cabo de conformidad con el Código Australiano de Prácticas para el Cuidado y Uso de Animales con Fines Científicos (2006). HEMBRA ADULTA C57BL / 6 ratones utilizados para generar los resultados representativos se obtuvieron de los Servicios de Animales de Monash. Los ratones fueron alojados en una habitación específica libre de patógenos, temperatura y humedad controlada con un ciclo de luz-oscuridad de 12 h…

Representative Results

Cuando este procedimiento se ha seguido correctamente, un rastro de oscilación constante se crea en el software de análisis de datos. El procedimiento proporciona una traza respiratoria dentro de unos pocos minutos después de la configuración con los cálculos informáticos sencillos para determinar los parámetros respiratorios enumerados. Figura 5 representa una traza de respiración adecuado a partir de un ratón de control (sanos). Datos oscilante adecuado se produce cuando el animal no se mueve…

Discussion

La técnica descrita aquí es un método no invasivo para la evaluación de los parámetros respiratorios de ratones sin restricciones y sin anestesiar. Los puntos fuertes de este protocolo son su simplicidad y precisión para medir la función pulmonar longitudinalmente con artefactos mínimos. Hay, sin embargo, algunas limitaciones y pasos críticos que se observaron sobre el procedimiento. En primer lugar y lo más importante, el ratón debe mantener la calma dentro de la cámara durante un mínimo de cinco segundos….

Materials

LabChart 7 software (for Macintosh)	ADINSTRUMENTS	MLU60/7	used in protocol step 4
PowerLab 8/30 (model ML870)	ADINSTRUMENTS	PL3508
Octal Bridge Amp (model ML228)	ADINSTRUMENTS	FE228
Black BNC to BNC cable (1m)	ADINSTRUMENTS	MLAC01
Macintosh OS	Apple Inc.	–	Mac OS X 10.4 or later
Surgipack Digital Rectal Thermometer	Vega Technologies	MT-918
Grass volumeteric pressure transducer PT5A	Grass Instruments Co.	Model number PT5A; serial No. L302P4.
1ml Syringe	Becton Dickinson (BD)	309628
5ml serological syringe pipettes	Greiner Bio One	606160	Connected via plastic tubing
Balance/Scales	VWR International, Pty Ltd	SHIMAUW220D	Any weighing balance with of 0.1 gram resolution
HM40 Humidity & temperature meter	Vaisala	HM40A1AB
Barometer	Barometer World	1586
Laboratory tubing	Dow Corning	508-101	Used to connect water column to the syringe and pressure transducer
Cylindrical Perspex Chamber	Dynalab Corp.		Custom built cylindrical chamber with internal dimensions as follows: 50mm(w) x 1500mm(l). There are two lids for each side, with dimensions 80mm(l) x 80mm(w). Each lid has a 60mm wide circular hole cut on the face of the lid 50mm deep. This allows the chamber to fit into the lid. A rubber ring is fitted around each hole of the lid where the chamber will fit. For attachment of syringe and pressure transducer, the openings are 5mm in diameter. For attachment of humidity probe, the openings are 25mm in diameter.
80% Ethanol (4L)	VWR International, Pty Ltd	BDH1162-4LP