Modelagem astrocitoma Patogênese<em> In Vitro</em> E<em> In Vivo</em> Usando Cortical astrócitos ou células-tronco neurais de condicional, Geneticamente Modificadas Ratos

Summary

Phenotypically wild-type astrocytes and neural stem cells harvested from mice engineered with floxed, conditional oncogenic alleles and transformed via viral Cre-mediated recombination can be used to model astrocytoma pathogenesis in vitro and in vivo by orthotopic injection of transformed cells into brains of syngeneic, immune-competent littermates.

Abstract

Current astrocytoma models are limited in their ability to define the roles of oncogenic mutations in specific brain cell types during disease pathogenesis and their utility for preclinical drug development. In order to design a better model system for these applications, phenotypically wild-type cortical astrocytes and neural stem cells (NSC) from conditional, genetically engineered mice (GEM) that harbor various combinations of floxed oncogenic alleles were harvested and grown in culture. Genetic recombination was induced in vitro using adenoviral Cre-mediated recombination, resulting in expression of mutated oncogenes and deletion of tumor suppressor genes. The phenotypic consequences of these mutations were defined by measuring proliferation, transformation, and drug response in vitro. Orthotopic allograft models, whereby transformed cells are stereotactically injected into the brains of immune-competent, syngeneic littermates, were developed to define the role of oncogenic mutations and cell type on tumorigenesis in vivo. Unlike most established human glioblastoma cell line xenografts, injection of transformed GEM-derived cortical astrocytes into the brains of immune-competent littermates produced astrocytomas, including the most aggressive subtype, glioblastoma, that recapitulated the histopathological hallmarks of human astrocytomas, including diffuse invasion of normal brain parenchyma. Bioluminescence imaging of orthotopic allografts from transformed astrocytes engineered to express luciferase was utilized to monitor in vivo tumor growth over time. Thus, astrocytoma models using astrocytes and NSC harvested from GEM with conditional oncogenic alleles provide an integrated system to study the genetics and cell biology of astrocytoma pathogenesis in vitro and in vivo and may be useful in preclinical drug development for these devastating diseases.

Introduction

Astrocitomas são o tumor cerebral primário mais comum e glioblastoma (GBM), a IV astrocitoma grau, é o subtipo mais comum e agressivo, com uma sobrevida média de 12-15 meses ^1,2. Invasão de astrocitomas difusos, particularmente GBM, opõe-se a ressecção cirúrgica completa, limita a eficácia de terapias adjuvantes, e inevitavelmente leva a recorrência pós-tratamento ^3. Inicialmente, os pacientes apresentam, quer com de novo (primário) GBM ou com astrocitoma grau menor que inevitavelmente progride para GBM (secundário) ^4. GBM é genomicamente heterogêneo e caracterizado por mutações que se excluem mutuamente e que co-ocorrem em genes que governam três principais vias de sinalização: o G ₁ / S (Rb) checkpoint do ciclo celular, receptor tirosina quinase (RTK), e TP53 vias ^5-7. GBM é composta por quatro subtipos do genoma com perfis de expressão distintos que se assemelham a diferentes tipos de células do cérebro, sugerindo que o GBM subtipo é influciada por sua célula de origem ^6,8,9. Modelos astrocitoma melhores são necessários para definir o papel de combinações específicas de mutações em determinados tipos de células durante astrocitoma patogênese. Aproveitando esses modelos para o desenvolvimento de drogas mais eficientes pré-clínico, em última instância ajudar a melhorar os resultados dos pacientes. Astrocitoma modelos atuais incluem linhas celulares estabelecidas humanos, paciente derivado xenotransplantes (PDX), astrócitos humanos normais geneticamente modificados e de células-tronco neurais (NSC) e camundongos geneticamente modificados (GEM) ^10-14. Nós desenvolvemos uma alternativa, GEM não germinativa (nGEM) modelo ¹⁵ utilizando células cerebrais primários – astrócitos corticais e NSC – colhidas GEM abrigando várias combinações de alelos oncogênicos floxed. O objectivo foi o de gerar modelos astrocitoma com células geneticamente definidas que poderia ser fenotipicamente caracterizadas tanto in vitro como in vivo e potencialmente utilizados para o desenvolvimento pré-clínico de drogas em icamundongos mmune-competentes.

Linhagens de células humanas estabelecidas são o modelo mais comumente usado de patogênese astrocitoma e resposta à droga in vitro e in vivo. Eles são tecnicamente simples, amplamente disponível, e definiram cinética e tumorigenicity sobre xeno ortotópico em ratos imunodeficientes ^10,11,16-18 . Suas desvantagens incluem a incapacidade de gerar linhagens celulares estabelecidas de astrocitomas de baixo grau, limitando estudo apenas para astrocitomas de alto grau; falta de uma célula de origem definido; a presença de anormalidades genômicas complexas, muitas vezes com perfis genômicos que diferem acentuadamente a partir da amostra original do doente; e susceptibilidade à fenotípica e genotípica de deriva durante a cultura de série no soro ^11,17,19-22. As conseqüências fenotípicas de mutações oncogênicas individuais em linhas de células humanas estabelecidas GBM pode ser mascarado pela multidão de anomalias que estão realmente presentes, que muitas vezes impede elucdação das conseqüências diretas genótipo-fenótipo.

PDX são gerados através da passagem subcutânea de células astrocitoma isolado do paciente em ratos imunodeficientes ou através de sua cultura como esferóides não aderentes em definido, meio sem soro antes da injeção ortotópico em cérebros de ratos imunodeficientes ^12,23. PDX manter com maior precisão a paisagem genómico de astrocitomas humanos, mas semelhante às linhas de células humanas estabelecidas, o efeito de mutações oncogénicas fenotípica individuais pode ser mascarado pela sua complexidade genómico ^19,24. Para definir as conseqüências fenotípicas de mutações oncogênicas específicas, particularmente em resposta a novas terapias, painéis de linhas de células humanas estabelecidas ou PDX são freqüentemente utilizados para estabelecer correlações genótipo-fenótipo, mostrar generalização, e minimizar a probabilidade de efeitos específicos de linha celular. Enquanto PDX recapitular com precisão as características histopatológicas de astrocitoma humano, including invasão, xenotransplantes ortotópico de linhas de células humanas estabelecidas geralmente não ^21,23,25. Além disso, os astrócitos humanos normais e NSC foram geneticamente modificadas com mutações oncogênicas definidas para modelar astrocitoma tumorigênese in vitro e in vivo ^13,14,26. Estas células não possuem a complexidade genómico de linhas celulares humanas estabelecidas e PDX e recapitulam precisão histopatologia astrocitoma humano, mas requerem xeno em roedores imunodeficientes in vivo. Como todos os modelos de células humanas exigem hospedeiros roedores imunodeficientes para evitar a rejeição de xenotransplante imunomediada, estes modelos não recapitular as interações tumor-estroma nativas de um sistema singênico e falta de um sistema imunológico intacto, limitando a investigação pré-clínica de alvo-estroma e imunomoduladores terapias ^10,11.

GEM exame autorização das conseqüências fenotípicas de combinações pré-determinadas de muta oncogênicoções in vivo durante a tumorigênese situ. Considerando GEM não condicional têm mutações em todos os tecidos ao longo do desenvolvimento, GEM condicional têm floxed alelos oncogênicos que permitem a segmentação de mutações, restringindo recombinação Cre-mediada para tipos específicos de células através do uso de celulares promotores específicos do tipo ^10,11,15,18. Condicional GEM astrocitoma foram utilizados para elucidar os papéis funcionais de mutações oncogénicas em tipos de células distintos dentro de um cérebro intacta ^11. A utilidade em pré-clínico da gliomagênese situ utilizando GEM condicional é limitada por um certo número de factores, incluindo 1) a ausência de uma correlação in vitro, 2) dificuldade em gerar grandes grupos de ratinhos com genótipos complexos, 3) de comprimento de latência para o desenvolvimento de tumor in situ , 4) e estocástica progressão tumoral. Porque in situ tumorigenesis carece de um modelo correspondente in vitro, testes de drogas in vitro não pode ser realizada wmodelos condicionais convencionais om jóia. Em contraste com outros tipos de câncer, os modelos GEM condicionais de astrocitoma raramente são induzidas por simples mutações oncogênicas ^11. Assim, esquemas de melhoramento complexas são necessárias para gerar GEM condicional com múltiplas mutações oncogênicas. Além disso, a iniciação astrocitoma ocorre com penetrância variável depois de um longo período de latência nesses modelos, enquanto a progressão para astrocitomas de alto grau geralmente ocorre de forma não-uniforme, estocástica e, finalmente, dá origem a tumores com paisagens genômicas complexas e cinética de crescimento rápido ^{27, 28.} A penetrância variável e natureza estocástica de progressão maligna em modelos GEM condicional exige que os ratos individuais ser rastreada por radiografia para detectar a presença e localização de astrocitomas de alto grau antes de sua inclusão em estudos pré-clínicos de drogas. Tomados em conjunto, estas limitações impedir a geração e ensaios dos grandes grupos de GEM condicional necessário para prtestes de drogas eClinical.

O sistema GEM RCAS-tva, que utiliza retrovirais aviária (RCAS) vectores para infectar GEM manipuladas para expressar o receptor viral (TVA) em tipos de células neurais específicos, tem sido extensivamente utilizado para modelar astrocitoma tumorigénese ^11. Em contraste com a GEM condicional, este sistema modelo permite a introdução de múltiplas mutações oncogénicas em tipos de células específicas, sem a necessidade de sistemas complexos de reprodução. No entanto, é limitado por uma penetrância variável, o requisito para a divisão activa de células para alcançar a integração virai, e a inserção dos transgenes aleatoriamente no genoma do hospedeiro ^29.

Modelos não-germinativas GEM (nGEM), que utilizam células colhidas de GEM, estão se tornando cada vez mais importante, porque eles superar muitas das limitações de outros sistemas modelo ^15. O papel do tipo de célula e de iniciar as mutações que ocorrem simultaneamente em astrocitoma patogénese são de difícil dissuadirmina usando linhas celulares estabelecidas humanas ou GBM PDX porque são derivados a partir de tumores em fase terminal que se acumularam extensas mutações genéticas em tipos de células não definidas durante o curso da progressão maligna. Em contraste, todos os graus de astrocitomas pode ser modelada utilizando nGEM definido por induzir mutações genéticas dentro tipos de células cerebrais específicas purificadas ^11,30. Assim, a influência de mutações genéticas específicas e tipo de células em fenótipos celulares e moleculares pode ser determinada in vitro e in vivo. Semelhante às linhas de células humanas estabelecidas GBM, em testes in vitro inicial de droga usando nGEM pode ser usado para dar prioridade drogas para os ensaios in vivo, utilizando as mesmas células. Tumorigénese in vivo pode ser determinada por aloenxerto células nGEM ortotopicamente nos cérebros de ninhada singeneicos imunocompetentes ^30. Estes modelos de aloenxerto ortotópico, pois, permitir testes in vivo, não só de um citotóxico convencionalnd terapias-alvo, mas imunomoduladores e de terapias alvo-estroma também. Finalmente, o papel do microambiente no início e progressão do tumor pode ser determinada por comparação dos resultados entre nGEM e modelos GEM convencionais utilizando as mesmas mutações nos mesmos tipos de células.

Nós e outros desenvolveram astrocitoma nGEM usando células primárias – astrócitos, NSC, ou células precursoras de oligodendrócitos (OPC) – colhidas GEM ^30-34. A lógica por trás do desenvolvimento de um astrocitoma nGEM era criar um modelo para determinar as conseqüências fenotípicas de mutações oncogênicas em tipos específicos de células que poderiam ser usados ​​para testes de drogas pré-clínicos in vitro e in vivo em animais imunocompetentes. Colhemos astrócitos fenotipicamente WT corticais e NSC de não-Cre expressar, GEM condicional mantida em um> 94% C57 / Bl6 fundo com caminho RB floxed – Rb1 ^{loxP / loxP,} ou TgGZT121 – e floxed RTK / RAS / PI3K – Nf1 ^{loxP / loxP,} Kras ^G12D, Pten ^{loxP / loxP} – genes em várias combinações ^35-39. Nós induzida recombinação genética in vitro utilizando vetores de adenovírus que codificam Cre recombinase. Porque colheitas astrócitos corticais contêm uma mistura de tipos de células, foram utilizados os vectores Ad5GFAPCre ou transgenes oncogénicos dominantes, tais como TgGZT ₁₂₁ dirigido a partir do promotor GFAP humana, para enriquecer para GFAP ⁺ astrócitos corticais nestas culturas. Definimos as consequências fenotípicas de G ₁ / S (RB), MAPK, e mutações PI3K em astrócitos corticais e NSC in vitro e in vivo. MAPK e PI3K-ativado via G1 / S-defeituosos astrócitos molecularmente imitou GBM humano proneural e, após a injeção ortotópico, tumores formados em um local pré-definido com cinética de crescimento uniforme, latências curtas, eo histopatológicosal marcas de GBM humano ^30. Monitorização longitudinal do crescimento do tumor in vivo ajuda de testes pré-clínicos de drogas através da normalização de coortes de tratamento e análise quantitativa do crescimento do tumor, em resposta ao tratamento com ^40. Determinou-se a cinética de crescimento do tumor por imagem de bioluminescência longitudinal de camundongos injetados com luciferase expressando astrócitos corticais. Portanto, os astrócitos corticais e NSC derivados GEM condicional fornecer um sistema modelo tratável para a definição de repercussão funcional de mutações associadas à astrocitoma e um sistema modelo potencial para o desenvolvimento de fármacos pré-clínicos.

Protocol

Todos os estudos com animais foram aprovados pela Universidade da Carolina do Norte Animal Care Institucional e Comitê de Uso. 1 A cultura Cortical astrócitos de Neonatal Ratos Preparação Amassar 2-3 tecidos tarefa delicada e colocar no fundo de um balão que continha 70% de etanol. Coloque tesouras de dissecação, pinças curvas e 2 pares de micro fórceps direto para este frasco. Os tecidos são usados ​​para evitar entortar os micro fórceps. Adicion…

Representative Results

Foi desenvolvido um sistema de modelo nGEM com astrócitos corticais e NSC colhidas de abrigar GEM neonatal floxed alelos oncogênicos condicional que pode ser fenotipicamente caracterizados in vitro e in vivo (Figura 1). A fim de investigar os efeitos de mutações oncogénicas especificamente em astrócitos do córtex in vitro, que é crítico para o primeiro enriquecimento em astrócitos. Colheitas de astrócitos corticais conter uma mistura de microglia, astrócitos, oligodendróci…

Discussion

Os passos mais críticos para assegurar a colheita e a cultura de astrócitos do córtex são 1) adequada para excisar o córtex sem tomar tecido abaixo do corpo caloso, 2) para remover as meninges, 3) para dissociar completamente as células, e 4) para o enriquecimento para a GFAP ⁺ astrócitos. Embora utilizando mecânica (agitação), e genética (restrição de recombinação genética com um vector Ad5GFAPCre ou utilização de um transgene transformadora dominante (TgGZT ₁₂₁₎ sob o c…

Materials

Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) (1X)	Invitrogen	11995065	DMEM can also be purchased from other suppliers including GIBCOSigma and Cellgro
Fetal Bovine Serum, Regular	Cellgro	35-010-CV
Penicillin-Streptomycin	Invitrogen	15140122
Sharp-Pointed Dissecting Scissors	Fisher Scientific	08-395
Cartilage Thumb Forceps, Curved	Fisher Scientific	1631
Miltex 17-301 Style 1 Jeweler Style Forceps, Fine, 4	Miltex	17-301
Ethanol (200 proof)	Decon Labs	2710
Razor Blades	VWR	55411-050
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) (1X), liquid	Invitrogen	14175-095
TrypLE Express (1X), Phenol Red	Invitrogen	12605-010	Other Trypsin solutions are also suitable for cortical astrocyte havest and culture
CULTURE DISH, 60 x 15 mm	Thomas Scientific	9380H77
15 ml tubes	BD Biosciences	352096
50 ml tubes	BD Biosciences	352070
Adenovirus stock	Gene Transfer Vector Core, U. Iowa	Ad5CMVCre	Store in 5 µl aliquots at -80 C. Hazardous.  Use Bsl2 safetyy  precautions
Sodium sulfate (Na2SO4)	Sigma-Aldrich	238597
Potassium sulfate (K2SO4)	Sigma-Aldrich	221325
Magnesium chloride (MgCl2)	Sigma-Aldrich	M8266
Calcium chloride (CaCl2)	Sigma-Aldrich	746495
HEPES potassium salt	Sigma-Aldrich	H0527
D-(+)- Glucose	Sigma-Aldrich	G8270
Phenol Red	Sigma-Aldrich	P3532
Sodium hydroxide (NaOH)	Sigma-Aldrich	S5881
Papain	Worthington	LS003127
L-Cysteine-HCl	Sigma-Aldrich	C1276
Syringe filter (0.22 µm pore size)	Millipore	SLGP033NS
Neurocult proliferation kit, mouse	Stemcell Technologies	5702	This kit contains the NeuroCult NSC Basal Medium and NeuroCult NSC supplement needed for NSC culture
0.2% Heparin solution	Stemcell Technologies	7980
EGF	Invitrogen	PMG8041
bFGF	Invitrogen	PHG0261
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) (10X)	Invitrogen	14185-052
Magnesium sulfate (MgSO4)	Sigma-Aldrich	M7506
Sodium bicarbonate (NaHCO3)	Sigma-Aldrich	S5761
E-64	Sigma-Aldrich	E3132	Make 10 mM stock in DMSO, store at -20 °C
6-well plates	Fisher Scientific	07-200-83
Cell strainer (40 µm pore size)	Corning	352340
Stem cell dissociation solution	Stemcell Technologies	5707	Alternatively, use gentle enzyme solutions such as Accutase
Methyl cellulose 15 cP	Sigma-Aldrich	M7027
Dulbecco's Modified Eagle's Media 2X	Millipore	SLM-202-B	For making 5% methyl cellulose solution
1.7mL Snap Cap Microcentrifuge Tube	Corning	3620
Hamilton syringe, 250 µl LT no needle	Fisher Scientific	14-815-92
PB600-1 Antigen Dispenser	Hamilton	83700
Disposable 18 ga needles	Fisher Scientific	NC9015638
27 ga 1/2" luer tip needle	Fisher Scientific	14-826-48
2,2,2-Tribromoethanol (Avertin)	Sigma-Aldrich	T48402
Betadine	Fisher Scientific	NC9386574
Puralube Opthalmic Ointment	Fisher Scientific	NC9689910
Model 900 Stereotaxic frame	Kopf Instruments
VETBOND	Fisher Scientific	NC9259532	Tissue adhesive
Lidocaine	ShopMedVet	RXLIDO-EPI
CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay (MTS)	Promega	G3580
Anti-Sox2	Millipore	AB5603
Polyclonal Rabbit Anti-Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP)	Dako	Z0334
IVIS Kinetic	PerkinElmer		For in vivo imaging
D-Luciferin – K+ Salt Bioluminescent Substrate	PerkinElmer	122796	For in vivo bioluminescence imaging
EdU Imaging Kit	Invitrogen	C10340
MSCV Luciferase PGK-hygro	Addgene	18782