النمذجة الخلايا النجمية إمراض<em> في المختبر</em> و<em> في فيفو</em> استخدام القشرية النجمية أو الخلايا الجذعية العصبية من الشرطي، الفئران المهندسة وراثيا
Summary
Phenotypically wild-type astrocytes and neural stem cells harvested from mice engineered with floxed, conditional oncogenic alleles and transformed via viral Cre-mediated recombination can be used to model astrocytoma pathogenesis in vitro and in vivo by orthotopic injection of transformed cells into brains of syngeneic, immune-competent littermates.
Abstract
Current astrocytoma models are limited in their ability to define the roles of oncogenic mutations in specific brain cell types during disease pathogenesis and their utility for preclinical drug development. In order to design a better model system for these applications, phenotypically wild-type cortical astrocytes and neural stem cells (NSC) from conditional, genetically engineered mice (GEM) that harbor various combinations of floxed oncogenic alleles were harvested and grown in culture. Genetic recombination was induced in vitro using adenoviral Cre-mediated recombination, resulting in expression of mutated oncogenes and deletion of tumor suppressor genes. The phenotypic consequences of these mutations were defined by measuring proliferation, transformation, and drug response in vitro. Orthotopic allograft models, whereby transformed cells are stereotactically injected into the brains of immune-competent, syngeneic littermates, were developed to define the role of oncogenic mutations and cell type on tumorigenesis in vivo. Unlike most established human glioblastoma cell line xenografts, injection of transformed GEM-derived cortical astrocytes into the brains of immune-competent littermates produced astrocytomas, including the most aggressive subtype, glioblastoma, that recapitulated the histopathological hallmarks of human astrocytomas, including diffuse invasion of normal brain parenchyma. Bioluminescence imaging of orthotopic allografts from transformed astrocytes engineered to express luciferase was utilized to monitor in vivo tumor growth over time. Thus, astrocytoma models using astrocytes and NSC harvested from GEM with conditional oncogenic alleles provide an integrated system to study the genetics and cell biology of astrocytoma pathogenesis in vitro and in vivo and may be useful in preclinical drug development for these devastating diseases.
Introduction
Astrocytomas هي ورم في المخ الأولية الأكثر شيوعا وورم أرومي دبقي (GBM)، والصف الرابع نجمي، هو النوع الفرعي الأكثر شيوعا وعدوانية مع بقاء متوسط من 12-15 شهرا 1،2. غزو astrocytomas منتشر، خاصة GBM، يحول دون الاستئصال الجراحي الكامل، ويحد من فعالية العلاجات المساعدة، وحتما يؤدي إلى تكرار بعد العلاج 3. المرضى في البداية الحالي إما مع دي نوفو (الابتدائي) GBM أو مع انخفاض astrocytomas الدرجة التي يتقدم حتما إلى (الثانوي) GBM 4. GBM هو غير متجانس genomically وتميزت الطفرات يستبعد بعضها بعضا وتحدث المشارك في الجينات التي تتحكم في مسارات الإشارات الأساسية الثلاثة: مجموعة 1 / S (الميزانية العادية) حاجز دورة الخلية، مستقبلات التيروزين كيناز (RTK)، وTP53 مسالك 5-7. يتكون من أربعة أنواع فرعية GBM الجينومية مع ملامح التعبير المتميزة التي تشبه أنواع مختلفة من الخلايا في الدماغ، مما يشير إلى أن GBM هو نوع فرعي influالوسن بواسطة خلية منشئه 6،8،9. مطلوبة نماذج نجمي أفضل لتحديد دور مجموعات محددة من الطفرات في أنواع خلية معينة خلال نجمي المرضية. والاستفادة من هذه النماذج لأكثر كفاءة تطوير العقاقير قبل السريرية تساعد في نهاية المطاف تحسين نتائج المرضى. وتشمل النماذج الحالية نجمي إنشاء خطوط الخلايا البشرية، المريض المستمدة xenografts (PDX)، المعدلة وراثيا الخلايا النجمية الإنسان الطبيعية والخلايا الجذعية العصبية (NSC)، والفئران المعدلة وراثيا (GEM) 10-14. طورنا بديلا، GEM غير الجرثومية (nGEM) نموذج 15 باستخدام خلايا الدماغ الأساسية – الخلايا النجمية القشرية وNSC – تحصد من GEM بإيواء مجموعات مختلفة من الأليلات أنكجنيك floxed. وكان الهدف هو توليد نماذج نجمي مع الخلايا المحددة وراثيا التي يمكن وصفها ظاهريا سواء في المختبر وفي الجسم الحي، وربما استخدامها لتطوير العقاقير قبل السريرية في الاولالفئران مناعية الحكومية المختصة.
خطوط الخلايا البشرية أنشأ هي النموذج الأكثر شيوعا من ورم نجمي المرضية والاستجابة المخدرات في المختبر وفي الجسم الحي، وهي من الناحية الفنية على التوالي إلى الأمام، على نطاق واسع، وقد عرفت حركية وtumorigenicity على xenografting مثلي في الفئران العوز المناعي 10،11،16-18 . ومن عيوبها عدم القدرة على توليد خطوط الخلايا أنشئت من astrocytomas منخفض الدرجة، مما يحد من الدراسة فقط لastrocytomas عالية الجودة؛ عدم وجود خلايا محددة المنشأ؛ وجود تشوهات الجينية المعقدة، وغالبا مع التشكيلات الجينية التي تختلف بشكل ملحوظ من عينة المرضى الأصلي؛ والقابلية للالمظهرية والانجراف الوراثي خلال الثقافة التسلسلية في المصل 11،17،19-22. النتائج المظهرية للطفرات أنكجنيك الفردية في خطوط الخلايا GBM الإنسان المنشأة يمكن ملثمين من قبل العديد من التشوهات التي هي في الواقع الحاضر، والتي غالبا ما يحول دون elucidation من النتائج المباشرة الوراثي، النمط الظاهري.
يتم إنشاؤها من خلال PDX مرور تحت الجلد من خلايا ورم نجمي معزولة المريض في الفئران العوز المناعي أو من خلال ثقافتهم الكروية وغير ملتصقة في تعريفها، وخالية من مصل المتوسطة قبل الحقن مثلي في أدمغة الفئران العوز المناعي 12،23. PDX المحافظة أكثر دقة المشهد الجيني من astrocytomas الإنسان، ولكن على غرار خطوط الخلايا البشرية المنشأة، وأثر المظهري من الطفرات أنكجنيك الفردية يمكن ملثمين بسبب التعقيد الجيني على 19،24. لتحديد عواقب المظهرية للطفرات أنكجنيك محددة، لا سيما في استجابة لعلاجات جديدة، وكثيرا ما تستخدم الألواح من خطوط الخلايا البشرية أنشأ أو PDX لإنشاء الارتباطات الوراثي، النمط الظاهري، وتظهر التعميم، وتقليل احتمال حدوث آثار خط معين الخلية. بينما PDX ألخص بدقة بصمات النسيجية المرضية من astrocytomas الإنسان، المؤتمر الوطني العراقيluding الغزو، xenografts مثلي من خطوط الخلايا البشرية أنشئت عموما لا 21،23،25. بالإضافة إلى ذلك، الخلايا النجمية الإنسان العادي ومجلس الأمن القومي تم هندستها وراثيا مع الطفرات أنكجنيك محددة لنموذج نجمي تكون الأورام في التجارب المختبرية والحية 13،14،26. هذه الخلايا تفتقر إلى التعقيد الجيني من خطوط الخلايا البشرية القائمة وPDX وألخص بدقة التشريح البشري نجمي، ولكن تتطلب xenografting في القوارض العوز المناعي في الجسم الحي. لأن كل نماذج الخلية البشرية تتطلب المضيفين لمنع القوارض العوز المناعي بوساطة المناعة رفض طعم أجنبي، فشلت هذه النماذج لتلخيص التفاعلات ورم سدى الأم لنظام مسانج وتفتقر إلى نظام المناعة سليمة، مما يحد من التحقيق قبل السريرية المستهدفة سدى والمناعة تغييري العلاجات 10،11.
GEM الفحص تصريح من عواقب المظهري من مجموعات محددة سلفا من مؤتة أنكجنيكستعقد تكون الأورام في الجسم الحي خلال موضعية. في حين GEM غير مشروط لديها طفرات في جميع أنحاء الأنسجة التنمية، GEM مشروط وfloxed الأليلات أنكجنيك التي تمكن استهداف الطفرات عن طريق تقييد إعادة التركيب لجنة المساواة العرقية بوساطة لأنواع معينة من الخلايا من خلال استخدام نوع معين الخلية المروجين 10،11،15،18. وقد استخدمت مشروط نجمي GEM لتوضيح الأدوار الوظيفية للطفرات أنكجنيك في أنواع الخلايا متميزة داخل الدماغ سليمة 11. الأداة المساعدة قبل السريرية من gliomagenesis في الموقع باستخدام GEM مشروط محدودة بسبب عدد من العوامل بما في ذلك 1) عدم وجود القرين في المختبر، 2) صعوبة في توليد أفواج كبيرة من الفئران مع الأنماط الوراثية المعقدة، 3) كمون طويلة من ورم في تطوير الموقع ، 4) والاستوكاستك تطور الورم. لأنه في الوضع الطبيعي تكون الأورام يفتقر إلى نموذج المقابلة في المختبر، اختبار المخدرات في المختبر لا يمكن إجراء ثإيث التقليدية نماذج GEM المشروطة. على عكس أنواع أخرى من السرطان، ونادرا ما يسببها نماذج GEM مشروطة من astrocytomas بواسطة الطفرات أنكجنيك واحدة 11. ومن ثم يلزم تربية مخططات معقدة لتوليد GEM مشروط مع الطفرات أنكجنيك متعددة. وعلاوة على ذلك، يحدث نجمي بدء مع انتفاذ متغير بعد فترة كمون طويلة في هذه النماذج، في حين تقدم لastrocytomas عالية الجودة يحدث عادة في غير موحدة، الطريقة العشوائية ويعطي في نهاية المطاف إلى نشوء الأورام مع المناظر الطبيعية الجينية المعقدة وحركية النمو السريع 27، 28. وانتفاذ متغير وطبيعة العشوائية من تطور خبيث في نماذج GEM مشروطة يتطلب أن الفئران الفردية يتم فحص التصوير الشعاعي بواسطة لاكتشاف وجود وموقع astrocytomas الدرجة العالية قبل تسجيلهم في التجارب قبل السريرية المخدرات. أخذت معا، وهذه القيود تعوق توليد واختبار أفواج كبيرة من GEM مشروط المطلوبة للعلاقات العامةeclinical اختبار المخدرات.
نظام GEM-TVA تقييمات النتائج والكفاءات، الذي يستخدم فيروسات الطيور (تقييمات النتائج والكفاءات) ناقلات لنقل العدوى GEM هندسيا للتعبير عن مستقبلات الفيروسي (TVA) على أنواع معينة الخلية العصبية، وقد استخدمت على نطاق واسع لنموذج نجمي تكون الأورام 11. على النقيض من GEM مشروط، وهذا النظام يتيح نموذج إدخال الطفرات أنكجنيك متعددة في أنواع خلايا معينة دون الحاجة لخطط تربية المعقدة. ومع ذلك، يقتصر من قبل انتفاذ متغير، شرط لتقسيم الخلايا بنشاط لتحقيق التكامل الفيروسي، والإدراج عشوائي من الجينات المحورة في جينوم المضيف 29.
غير الجرثومية GEM (nGEM) النماذج، التي تستخدم الخلايا تحصد من GEM، أصبحت ذات أهمية متزايدة لأنها التغلب على الكثير من أوجه القصور في أنظمة أخرى نموذج 15. دور الشروع في نوع من الخلايا والطفرات التي تحدث المشارك في نجمي المرضية من الصعب ردعالألغام باستخدام أنشئت خطوط الخلايا GBM الإنسان أو PDX لأنها مستمدة من الأورام في نهاية المرحلة التي تراكمت الطفرات الوراثية واسعة في أنواع الخلايا غير محددة أثناء تطور الخبيث. في المقابل، جميع الصفوف من astrocytomas يمكن نمذجة باستخدام nGEM عن طريق إحداث طفرات جينية محددة داخل أنواع محددة تنقية خلايا الدماغ 11،30. وهكذا، فإن تأثير الطفرات الجينية المحددة ونوع من الخلايا على الظواهر الخلوية والجزيئية يمكن تحديدها في المختبر وفي الجسم الحي. على غرار خطوط الخلايا GBM الإنسان المعمول بها، الأولي في المختبر اختبار المخدرات باستخدام nGEM يمكن استخدامها لتحديد أولويات العقاقير في الجسم الحي اختبار باستخدام الخلايا نفسها. تكون الأورام في الجسم الحي ومن ثم يمكن تحديد بواسطة allografting خلايا nGEM orthotopically في أدمغة تتزاحم مسانج المناعة المختصة 30. ولهذه النماذج طعم خيفي مثلي تسمح في الجسم الحي اختبار ليس فقط من التقليدية السامة للخلايا لالثانية المستهدفة العلاجات، ولكن المناعة تغييري والعلاجات المستهدفة سدى كذلك. أخيرا، يمكن تحديد دور المكروية على بدء الورم والتقدم من خلال مقارنة النتائج بين nGEM ونماذج GEM التقليدية باستخدام نفس الطفرات في أنواع الخلايا نفسها.
نحن وغيرنا قد وضعت نجمي nGEM باستخدام الخلايا الأولية – الخلايا النجمية، مجلس الأمن القومي، أو خلايا دبقية قليلة التغصن السلائف (OPC) – GEM تحصد من 30-34. كان المبرر وراء تطوير نجمي nGEM لخلق نموذج لتحديد عواقب المظهرية للطفرات أنكجنيك في أنواع معينة من الخلايا التي يمكن استخدامها لاختبار المخدرات قبل السريرية في المختبر والمجراة على الحيوانات في مأمن الحكومية المختصة. نحن حصاد الخلايا النجمية WT ظاهريا القشرية وNSC من غير لجنة المساواة العرقية، معربا، GEM مشروط الحفاظ على> 94٪ C57 / BL6 الخلفية مع مسار floxed RB – RB1 loxP / loxP، أو TgGZT121 – وfloxed RTK / RAS / مسار PI3K – NF1 loxP / loxP، KRAS G12D، PTEN loxP / loxP – الجينات في توليفات مختلفة 35-39. نحن الناجم عن إعادة التركيب الوراثي في المختبر باستخدام ناقلات الفيروسة الغدانية ترميز لجنة المساواة العرقية recombinase. لأن المحاصيل نجمية القشرية تحتوي على خليط من أنواع الخلايا، استخدمنا ناقلات Ad5GFAPCre أو الجينات المحورة أنكجنيك المهيمنة، مثل TgGZT 121 طردوا من المروج GFAP البشري، لإثراء لGFAP + الخلايا النجمية القشرية في هذه الثقافات. حددنا عواقب المظهري من G 1 / S (م ع)، MAPK، والطفرات في الخلايا النجمية مسار PI3K القشرية ومجلس الأمن القومي في المختبر وفي الجسم الحي. MAPK وPI3K تنشيط مسار G1 / S-المعيبة النجمية تحاكي جزيئيا GBM البشري proneural، وعند حقن مثلي، والأورام التي تشكلت في مكان محدد مسبقا مع حركية النمو موحدة، الإختفاء قصيرة، والنسيجيةبصمات القاعدة على الإنسان GBM 30. الرصد الطولي للنمو الورم في الجسم الحي الإيدز قبل السريرية لاختبار المخدرات من خلال تطبيع الأفواج العلاج والتحليل الكمي من نمو الورم في الاستجابة للعلاج 40. نحن مصممون حركية نمو الورم عن طريق التصوير تلألؤ بيولوجي الطولي للفئران حقنت وسيفيراز يعبرون عن الخلايا النجمية القشرية. ولذلك، الخلايا النجمية القشرية وNSC المستمدة من GEM مشروط توفر نظام نموذجي لين العريكة للتعريف عواقب وظيفية من الطفرات المرتبطة نجمي ونظام نموذج محتمل لتطوير العقاقير قبل السريرية.
Protocol
Representative Results
Discussion
الخطوات الأكثر أهمية لضمان حصاد والثقافة من الخلايا النجمية القشرية هي 1) السليم لاستئصال القشرة دون أخذ الأنسجة تحت الجسم الثفني، 2) لإزالة السحايا، 3) لفصل الخلايا تماما، و4) لإثراء لGFAP + الخلايا النجمية. على الرغم من أن كنا الميكانيكية (الهز) وراثي (تقييد إعادة ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
CRM is a Damon Runyon-Genentech Clinical Investigator. This work was supported, in part, by grants to CRM from the Damon Runyon Cancer Research Foundation (CI-45-09), Department of Defense (W81XWH-09-2-0042), and University of North Carolina University Cancer Research Fund (UCRF). The authors wish to thank Daniel Roth for mouse husbandry assistance. The authors also wish to thank Hannah Chae, Carter McCormick, Demi Canoutas, Stephanie Gillette, and Susannah Krom for tissue culture and immunofluorescence assistance.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) (1X) | Invitrogen | 11995065 | DMEM can also be purchased from other suppliers including GIBCOSigma and Cellgro |
| Fetal Bovine Serum, Regular | Cellgro | 35-010-CV | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140122 | |
| Sharp-Pointed Dissecting Scissors | Fisher Scientific | 08-395 | |
| Cartilage Thumb Forceps, Curved | Fisher Scientific | 1631 | |
| Miltex 17-301 Style 1 Jeweler Style Forceps, Fine, 4 | Miltex | 17-301 | |
| Ethanol (200 proof) | Decon Labs | 2710 | |
| Razor Blades | VWR | 55411-050 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) (1X), liquid | Invitrogen | 14175-095 | |
| TrypLE Express (1X), Phenol Red | Invitrogen | 12605-010 | Other Trypsin solutions are also suitable for cortical astrocyte havest and culture |
| CULTURE DISH, 60 x 15 mm | Thomas Scientific | 9380H77 | |
| 15 ml tubes | BD Biosciences | 352096 | |
| 50 ml tubes | BD Biosciences | 352070 | |
| Adenovirus stock | Gene Transfer Vector Core, U. Iowa | Ad5CMVCre | Store in 5 µl aliquots at -80 C. Hazardous. Use Bsl2 safetyy precautions |
| Sodium sulfate (Na2SO4) | Sigma-Aldrich | 238597 | |
| Potassium sulfate (K2SO4) | Sigma-Aldrich | 221325 | |
| Magnesium chloride (MgCl2) | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Calcium chloride (CaCl2) | Sigma-Aldrich | 746495 | |
| HEPES potassium salt | Sigma-Aldrich | H0527 | |
| D-(+)- Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| Phenol Red | Sigma-Aldrich | P3532 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma-Aldrich | S5881 | |
| Papain | Worthington | LS003127 | |
| L-Cysteine-HCl | Sigma-Aldrich | C1276 | |
| Syringe filter (0.22 µm pore size) | Millipore | SLGP033NS | |
| Neurocult proliferation kit, mouse | Stemcell Technologies | 5702 | This kit contains the NeuroCult NSC Basal Medium and NeuroCult NSC supplement needed for NSC culture |
| 0.2% Heparin solution | Stemcell Technologies | 7980 | |
| EGF | Invitrogen | PMG8041 | |
| bFGF | Invitrogen | PHG0261 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) (10X) | Invitrogen | 14185-052 | |
| Magnesium sulfate (MgSO4) | Sigma-Aldrich | M7506 | |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| E-64 | Sigma-Aldrich | E3132 | Make 10 mM stock in DMSO, store at -20 °C |
| 6-well plates | Fisher Scientific | 07-200-83 | |
| Cell strainer (40 µm pore size) | Corning | 352340 | |
| Stem cell dissociation solution | Stemcell Technologies | 5707 | Alternatively, use gentle enzyme solutions such as Accutase |
| Methyl cellulose 15 cP | Sigma-Aldrich | M7027 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Media 2X | Millipore | SLM-202-B | For making 5% methyl cellulose solution |
| 1.7mL Snap Cap Microcentrifuge Tube | Corning | 3620 | |
| Hamilton syringe, 250 µl LT no needle | Fisher Scientific | 14-815-92 | |
| PB600-1 Antigen Dispenser | Hamilton | 83700 | |
| Disposable 18 ga needles | Fisher Scientific | NC9015638 | |
| 27 ga 1/2" luer tip needle | Fisher Scientific | 14-826-48 | |
| 2,2,2-Tribromoethanol (Avertin) | Sigma-Aldrich | T48402 | |
| Betadine | Fisher Scientific | NC9386574 | |
| Puralube Opthalmic Ointment | Fisher Scientific | NC9689910 | |
| Model 900 Stereotaxic frame | Kopf Instruments | ||
| VETBOND | Fisher Scientific | NC9259532 | Tissue adhesive |
| Lidocaine | ShopMedVet | RXLIDO-EPI | |
| CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay (MTS) | Promega | G3580 | |
| Anti-Sox2 | Millipore | AB5603 | |
| Polyclonal Rabbit Anti-Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP) | Dako | Z0334 | |
| IVIS Kinetic | PerkinElmer | For in vivo imaging | |
| D-Luciferin – K+ Salt Bioluminescent Substrate | PerkinElmer | 122796 | For in vivo bioluminescence imaging |
| EdU Imaging Kit | Invitrogen | C10340 | |
| MSCV Luciferase PGK-hygro | Addgene | 18782 |
References
- Dolecek, T. A., Propp, J. M., Stroup, N. E., Kruchko, C. CBTRUS statistical report: primary brain and central nervous system tumors diagnosed in the United States in 2005-2009. Neuro Oncol. 14, 1-49 (2012).
- Stupp, R., et al. Radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma. New England Journal Of Medicine. 352 (10), 987-996 (2005).
- Giese, A., Bjerkvig, R., Berens, M. E., Westphal, M. Cost of migration: invasion of malignant gliomas and implications for treatment. J. Clin. Oncol. 21 (8), 1624-1636 (2003).
- Miller, C. R., Perry, A. Glioblastoma. Arch. Pathol. Lab. Med. 131 (3), 397-406 (2007).
- . Genome Atlas Research Network. Comprehensive genomic characterization defines human glioblastoma genes and core pathways. Nature. 455 (7216), 1061-1068 (2008).
- Verhaak, R. G., et al. Integrated genomic analysis identifies clinically relevant subtypes of glioblastoma characterized by abnormalities in PDGFRA, IDH1, EGFR, and NF1. Cancer Cell. 17 (1), 98-110 (2010).
- Brennan, C. W., et al. The somatic genomic landscape of glioblastoma. Cell. 155 (2), 462-477 (2013).
- Phillips, H. S., et al. Molecular subclasses of high-grade glioma predict prognosis, delineate a pattern of disease progression, and resemble stages in neurogenesis. Cancer Cell. 9 (3), 157-173 (2006).
- Vitucci, M., Hayes, D. N., Miller, C. R. Gene expression profiling of gliomas: merging genomic and histopathological classification for personalised therapy. Br. J. Cancer. 104 (4), 545-553 (2011).
- Sharpless, N. E., Depinho, R. A. The mighty mouse: genetically engineered mouse models in cancer drug development. Nat. Rev. Drug Discov. 5 (9), 741-754 (2006).
- Schmid, R. S., Vitucci, M., Miller, C. R. Genetically engineered mouse models of diffuse gliomas. Brain Res. Bull. 88 (1), 72-79 (2012).
- Siolas, D., Hannon, G. J. Patient-derived tumor xenografts: transforming clinical samples into mouse models. Cancer Res. 73 (17), 5315-5319 (2013).
- Sonoda, Y., et al. Formation of intracranial tumors by genetically modified human astrocytes defines four pathways critical in the development of human anaplastic astrocytoma. Cancer Res. 61 (13), 4956-4960 (2001).
- Mao, X. G., et al. LIN28A facilitates the transformation of human neural stem cells and promotes glioblastoma tumorigenesis through a pro-invasive genetic program. Oncotarget. 4 (7), 1050-1064 (2013).
- Heyer, J., Kwong, L. N., Lowe, S. W., Chin, L. Non-germline genetically engineered mouse models for translational cancer research. Nat. Rev. Cancer. 10 (7), 470-480 (2010).
- Miller, C. R., Williams, C. R., Buchsbaum, D. J., Gillespie, G. Y. Intratumoral 5-fluorouracil produced by cytosine deaminase/5-fluorocytosine gene therapy is effective for experimental human glioblastomas. Cancer Res. 62 (3), 773-780 (2002).
- Becher, O. J., Holland, E. C. Genetically engineered models have advantages over xenografts for preclinical studies. Cancer Res. 66 (7), 3355-3358 (2006).
- Huse, J. T., Holland, E. C. Genetically engineered mouse models of brain cancer and the promise of preclinical testing. Brain Pathol. 19 (1), 132-143 (2009).
- Lee, J., et al. Tumor stem cells derived from glioblastomas cultured in bFGF and EGF more closely mirror the phenotype and genotype of primary tumors than do serum-cultured cell lines. Cancer Cell. 9 (5), 391-403 (2006).
- Li, A., et al. Genomic changes and gene expression profiles reveal that established glioma cell lines are poorly representative of primary human gliomas. Mol. Cancer Res. 6 (1), 21-30 (2008).
- Vries, N. A., Beijnen, J. H., van Tellingen, O. High-grade glioma mouse models and their applicability for preclinical testing. Cancer Treat. Rev. 35 (8), 714-723 (2009).
- Clark, M. J., et al. U87MG decoded: the genomic sequence of a cytogenetically aberrant human cancer cell line. PLoS Genet. 6 (1), (2010).
- Carvalho, A. C., et al. Gliosarcoma stem cells undergo glial and mesenchymal differentiation in vivo. Stem Cells. 28 (2), 181-190 (2010).
- Yost, S. E., et al. High-resolution mutational profiling suggests the genetic validity of glioblastoma patient-derived pre-clinical models. PLoS One. 8 (2), (2013).
- Giannini, C., et al. Patient tumor EGFR and PDGFRA gene amplifications retained in an invasive intracranial xenograft model of glioblastoma multiforme. Neuro Oncol. 7 (2), 164-176 (2005).
- Rich, J. N., Guo, C., McLendon, R. E., Bigner, D. D., Wang, X. F., Counter, C. M. A genetically tractable model of human glioma formation. Cancer Res. 61 (9), 3556-3560 (2001).
- Chow, L. M., et al. Cooperativity within and among Pten, p53, and Rb pathways induces high-grade astrocytoma in adult brain. Cancer Cell. 19 (3), 305-316 (2011).
- Song, Y., et al. Evolutionary etiology of high-grade astrocytomas. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. , (2013).
- Werder, A., Seidler, B., Schmid, R. M., Schneider, G., Saur, D. Production of avian retroviruses and tissue-specific somatic retroviral gene transfer in vivo using the RCAS/TVA system. Nat. Protoc. 7 (6), 1167-1183 (2012).
- Vitucci, M., et al. Cooperativity between MAPK and PI3K signaling activation is required for glioblastoma pathogenesis. Neuro Oncol. 15 (10), 1317-1329 (2013).
- Yahanda, A. M., Bruner, J. M., Donehower, L. A., Morrison, R. S. Astrocytes derived from p53-deficient mice provide a multistep in vitro model for development of malignant gliomas. Mol. Cell. Biol. 15 (8), 4249-4259 (1995).
- McEllin, B., et al. PTEN loss compromises homologous recombination repair in astrocytes: implications for glioblastoma therapy with temozolomide or poly(ADP-ribose) polymerase inhibitors. Cancer Res. 70 (13), 5457-5464 (2010).
- Kim, H. S., et al. Gliomagenesis arising from Pten- and Ink4a/Arf-deficient neural progenitor cells is mediated by the p53-Fbxw7/Cdc4 pathway, which controls c-Myc. Cancer Res. 72 (22), 6065-6075 (2012).
- Radke, J., Bortolussi, G., Pagenstecher, A. Akt and c-Myc induce stem-cell markers in mature primary p53(-)/(-) astrocytes and render these cells gliomagenic in the brain of immunocompetent mice. PLoS One. 8 (2), (2013).
- Marino, S., Vooijs, M., Der Gulden, H. v. a. n., Jonkers, J., Berns, A. Induction of medulloblastomas in p53-null mutant mice by somatic inactivation of Rb in the external granular layer cells of the cerebellum. Genes Dev. 14 (8), 994-1004 (2000).
- Zhu, Y., et al. Ablation of NF1 function in neurons induces abnormal development of cerebral cortex and reactive gliosis in the brain. Genes Dev. 15 (7), 859-876 (2001).
- Jackson, E. L., et al. Analysis of lung tumor initiation and progression using conditional expression of oncogenic K-ras. Genes Dev. 15 (24), 3243-3248 (2001).
- Xiao, A., Wu, H., Pandolfi, P. P., Louis, D. N., Van Dyke, T. Astrocyte inactivation of the pRb pathway predisposes mice to malignant astrocytoma development that is accelerated by PTEN mutation. Cancer Cell. 1 (2), 157-168 (2002).
- Xiao, A., Yin, C., Yang, C., Di Cristofano, A., Pandolfi, P. P., Van Dyke, T. Somatic induction of Pten loss in a preclinical astrocytoma model reveals major roles in disease progression and avenues for target discovery and validation. Cancer Res. 65 (12), 5172-5180 (2005).
- Neill, K., Lyons, S. K., Gallagher, W. M., Curran, K. M., Byrne, A. T. Bioluminescent imaging: a critical tool in pre-clinical oncology research. J. Pathol. 220 (3), 317-327 (2010).
- McCarthy, K. D., de Vellis, J. Preparation of separate astroglial and oligodendroglial cell cultures from rat cerebral tissue. J. Cell Biol. 85 (3), 890-902 (1980).
- Azari, H., Sharififar, S., Rahman, M., Ansari, S., Reynolds, B. A. Establishing embryonic mouse neural stem cell culture using the neurosphere assay. J. Vis. Exp. (47), (2011).
- Giulian, D., Baker, T. J. Characterization of ameboid microglia isolated from developing mammalian brain. J. Neurosci. 6 (8), 2163-2178 (1986).
- Franken, N. A., Rodermond, H. M., Stap, J., Haveman, J., van Bree, C. Clonogenic assay of cells in vitro. Nat. Protoc. 1 (5), 2315-2319 (2006).
- Miller, C. R., Bash, R. E., Vitucci, M., White, K. K. A genetically-defined, orthotopic allograft model system of glioblastoma: Pathological features and experimental therapeutics. J. Neuropathol. Exp. Neurol. 69 (5), 522 (2011).
- Bash, R., et al. Concurrent temozolomide-external beam radiation therapy is effective for experimental glioblastomas in an orthotopic, genetically engineered syngeneic mouse allograft model system. Neuro Oncol. 11 (5), 638 (2009).
- Hamby, M. E., Uliasz, T. F., Hewett, S. J., Hewett, J. A. Characterization of an improved procedure for the removal of microglia from confluent monolayers of primary astrocytes. J. Neurosci. Meth. 150 (1), 128-137 (2006).
- Cahoy, J. D., et al. A transcriptome database for astrocytes, neurons, and oligodendrocytes: a new resource for understanding brain development and function. J. Neurosci. 28 (1), 264-278 (2008).
- Foo, L. C., et al. Development of a method for the purification and culture of rodent astrocytes. Neuron. 71 (5), 799-811 (2011).
- Rietze, R. L., Valcanis, H., Brooker, G. F., Thomas, T., Voss, A. K., Bartlett, P. F. Purification of a pluripotent neural stem cell from the adult mouse brain. Nature. 412 (6848), 736-739 (2001).
- Campisi, J. Aging, cellular senescence, and cancer. Annu. Rev. Physiol. 75, 685-705 (2013).
- Sirko, S., et al. Reactive glia in the injured brain acquire stem cell properties in response to sonic hedgehog. Cell stem cell. 12 (4), 426-439 (2013).
- Robel, S., Berninger, B., Gotz, M. The stem cell potential of glia: lessons from reactive gliosis. Nat. Rev. Neurosci. 12 (2), 88-104 (2011).
- Burrell, K., Agnihotri, S., Leung, M., Dacosta, R., Hill, R., Zadeh, G. A novel high-resolution in vivo imaging technique to study the dynamic response of intracranial structures to tumor growth and therapeutics. J. Vis Exp. e50363 (76), (2013).
- Sottoriva, A., et al. Intratumor heterogeneity in human glioblastoma reflects cancer evolutionary dynamics. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110 (10), 4009-4014 (2013).
- Snuderl, M., et al. Mosaic amplification of multiple receptor tyrosine kinase genes in glioblastoma. Cancer Cell. 20 (6), 810-817 (2011).
