JoVE Journal > Neuroscience
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
자동 번역
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
신경과학

דוגמנות אסטרוציטומה פתוגנזה<em> במבחנה</em> ו<em> בVivo</em> שימוש בקליפת מוח האסטרוציטים או בתאי גזע עצביים מעכברים מותנים, מהונדסים גנטי

Published: August 12, 2014
doi:
10.3791/51763
, , , , , , , ,
1Department of Pathology and Laboratory Medicine,University of North Carolina School of Medicine, 2Lineberger Comprehensive Cancer Center,University of North Carolina School of Medicine, 3Division of Neuropathology, Department of Pathology and Laboratory Medicine,University of North Carolina School of Medicine, 4Curriculum in Genetics and Molecular Biology,University of North Carolina School of Medicine, 5Biological and Biomedical Sciences Program,University of North Carolina School of Medicine, 6Department of Radiation Oncology,Emory University School of Medicine, 7Department of Neurology, Neurosciences Center,University of North Carolina School of Medicine

Summary

Phenotypically wild-type astrocytes and neural stem cells harvested from mice engineered with floxed, conditional oncogenic alleles and transformed via viral Cre-mediated recombination can be used to model astrocytoma pathogenesis in vitro and in vivo by orthotopic injection of transformed cells into brains of syngeneic, immune-competent littermates.

Abstract

Current astrocytoma models are limited in their ability to define the roles of oncogenic mutations in specific brain cell types during disease pathogenesis and their utility for preclinical drug development. In order to design a better model system for these applications, phenotypically wild-type cortical astrocytes and neural stem cells (NSC) from conditional, genetically engineered mice (GEM) that harbor various combinations of floxed oncogenic alleles were harvested and grown in culture. Genetic recombination was induced in vitro using adenoviral Cre-mediated recombination, resulting in expression of mutated oncogenes and deletion of tumor suppressor genes. The phenotypic consequences of these mutations were defined by measuring proliferation, transformation, and drug response in vitro. Orthotopic allograft models, whereby transformed cells are stereotactically injected into the brains of immune-competent, syngeneic littermates, were developed to define the role of oncogenic mutations and cell type on tumorigenesis in vivo. Unlike most established human glioblastoma cell line xenografts, injection of transformed GEM-derived cortical astrocytes into the brains of immune-competent littermates produced astrocytomas, including the most aggressive subtype, glioblastoma, that recapitulated the histopathological hallmarks of human astrocytomas, including diffuse invasion of normal brain parenchyma. Bioluminescence imaging of orthotopic allografts from transformed astrocytes engineered to express luciferase was utilized to monitor in vivo tumor growth over time. Thus, astrocytoma models using astrocytes and NSC harvested from GEM with conditional oncogenic alleles provide an integrated system to study the genetics and cell biology of astrocytoma pathogenesis in vitro and in vivo and may be useful in preclinical drug development for these devastating diseases.

Introduction

Astrocytomas הוא הגידול השכיח ביותר העיקרי המוח וגליובלסטומה (GBM), אסטרוציטומה IV כיתה, הוא תת הסוג הנפוץ ואגרסיווי ביותר עם ​​חציון הישרדות של 12-15 חודשים 1,2. פלישה של astrocytomas המפוזר, במיוחד GBM, מונעת כריתה כירורגית מלאה, מגבילה את האפקטיביות של טיפולי אדג'ובנט, ומובילה בהכרח להישנות לאחר טיפול 3. חולים בתחילה הווה או עם דה נובו GBM (העיקרי) או עם astrocytomas ציון נמוך שאופן בלתי נמנע מתקדם לGBM (המשני) 4. GBM הוא genomically הטרוגניות ומאופיין במוטציות מוציאות ושיתוף המתרחש בגנים ששולטים בשלושה מסלולי ליבת איתות: מחסום מחזור תא G 1 / S (Rb), טירוזין קינאז רצפטור (RTK), וTP53 מסלולי 5-7. GBM מורכב מארבעה תת סוגים הגנומי עם פרופילי ביטוי שונים שדומים סוגי תאים שונים במוח, המצביע על כך תת סוג GBM הוא influמושפע מתאה של 6,8,9 מוצא. מודלים אסטרוציטומה טובים יותר נדרשים כדי להגדיר את התפקיד של שילובים מסוימים של מוטציות בסוגים מסוימים של תאים בפתוגנזה אסטרוציטומה. מינוף מודלים אלה לפיתוח תרופה פרה קליני יעיל יותר סופו של דבר לעזור לשפר את תוצאות מטופל. מודלים אסטרוציטומה הנוכחיים כוללים הוקמו שורות תאים אנושיות, xenografts חולה נגזר (PDX), האסטרוציטים אדם נורמלים מהונדסים גנטי ותאי גזע עצביים (המל"ל), ועכברים מהונדסים גנטי (GEM) 10-14. פיתחנו חלופי, GEM לא בתאי מין מודל (nGEM) 15 ניצול תאים ראשוניים במוח – קליפת המוח האסטרוציטים ומועצה לביטחון לאומית – שנקטפו מן GEM מחסה שילובים שונים של אללים שעור floxed. המטרה הייתה ליצור מודלים אסטרוציטומה עם תאים מוגדרים גנטי שיכולה להיות מאופיין phenotypically הן במבחנה in vivo ובאופן פוטנציאלי מנוצלים לפיתוח תרופות פרה קליני בiעכברי mmune-מוסמך.

שורות תאים אנושיות שהוקמו הן המודל הנפוץ ביותר של הפתוגנזה אסטרוציטומה ותגובת תרופה במבחנת in vivo. הם מבחינה טכנית ישר קדימה, זמינים באופן נרחב, והגדירו קינטיקה וtumorigenicity על xenografting orthotopic בעכברי immunodeficient 10,11,16-18 . החסרונות שלהם כוללים את חוסר היכולת ליצור שורות תאים הוקמו מastrocytomas בדרגה נמוכה, הגבלת הלימוד רק לastrocytomas בדרגה גבוהה; חוסר תא מוגדר של מקור; הנוכחות של חריגות הגנומי מורכבות, לעתים קרובות עם פרופילים גנומיים הנבדלים במידה ניכרת ממדגם החולה המקורי; ורגישות לפנוטיפי ולהיסחף genotypic במהלך התרבות סידורי בסרום 11,17,19-22. ההשלכות פנוטיפי של מוטציות סרטניות בודדות בשורות תאי GBM הוקמו אנושיות יכולות להיות רעול פנים על ידי המון פגמים שהם בעצם הווה, שלעתים קרובות הוא מונע elucidation של השלכות גנוטיפ פנוטיפ ישירות.

PDX נוצרים באמצעות מעבר תת עורית של תאי אסטרוציטומה מבודד מטופל בעכברי immunodeficient או דרך התרבות שלהם כspheroids שאינו חסיד שבהוגדר בינוני סרום ללא, לפני הזרקת orthotopic לתוך מוחם של עכברי immunodeficient 12,23. PDX בצורה מדויקת יותר לשמור על הנוף הגנומי של astrocytomas האנושי, אבל דומה לשורות תאים אנושיות שהוקמו, ההשפעה פנוטיפי של מוטציות סרטניות בודדות יכולה להיות רעול פנים בשל המורכבות הגנומי שלהם 19,24. כדי להגדיר את ההשלכות פנוטיפי של מוטציות סרטניות ספציפיות, במיוחד בתגובה לטיפולים חדשניים, פנלים של קווים הוקמו תא אנושיים או PDX לעתים קרובות מנוצלים כדי להקים מתאמי גנוטיפ, פנוטיפ, להראות יכולת הכללה, ולמזער את הסבירות להשפעות של קו ספציפי תא. בעוד PDX במדויק לשחזר את סימני ההיכר histopathological של astrocytomas האנושי, including פלישה, xenografts orthotopic של שורות תאים אנושיות שהוקמו בדרך כלל לא 21,23,25. בנוסף, האסטרוציטים אדם נורמלים ומועצה לביטחון לאומית כבר מהונדסים גנטיים עם מוטציות סרטניות מוגדרות למודל יצירת גידולי אסטרוציטומה במבחנת in vivo 13,14,26. תאים אלה חסרים את המורכבות הגנומי של קווים הוקמו תא אנושיים וPDX ובאופן מדויק לשחזר היסטופתולוגיה אסטרוציטומה אנושית, אך דורשים xenografting במכרסמים immunodeficient in vivo. מכיוון שכל דגמי התא האנושיים דורשים מארחי מכרסמים immunodeficient למניעת דחיית xenograft בתיווך חיסונית, דגמים אלה אינם לשחזר את אינטראקציות גידולי סטרומה יליד מערכת syngeneic וחסרי מערכת חיסונית שלמה, הגבלת חקירה פרה קלינית של חיסון modulatory הממוקד סטרומה ו טיפול בעזרת 10,11.

בדיקת היתר GEM של ההשלכות פנוטיפי של שילובים קבועים מראש של muta שהעורמשא in vivo ביצירת גידולי אתר. והואיל ולGEM שאינו מותנה מוטציות בתוך כל הרקמות בפיתוח, GEM המותנה שfloxed אללים שעור המאפשרים מיקוד של מוטציות על ידי הגבלת רקומבינציה בתיווך Cre לסוגי תאים מסוימים באמצעות שימוש במקדמי הסוג ספציפי של תאי 10,11,15,18. GEM אסטרוציטומה המותנה כבר נוצל כדי להבהיר את התפקידים הפונקציונליים של מוטציות סרטניות בסוגים שונים של תאים בתוך מוח שלם 11. השירות פרה הקליני של בgliomagenesis אתר באמצעות GEM המותנה מוגבל על ידי מספר גורמים, כולל 1) חוסר לתאם במבחנה, 2) קושי ביצירת קבוצות גדולות של עכברים עם גנוטיפים מורכבים, 3) חביון ארוכה של בהתפתחות גידולים באתר , 4) וסטוכסטיים התקדמות גידול. כי באתרו יצירה גידולים חסר מודל מתאים במבחנה, בדיקות סמים במבחנה לא ניתן לבצע wמודלים ith קונבנציונליים מותנים GEM. בניגוד לסוגי סרטן אחר, מודלים GEM מותנים של astrocytomas מושרים לעתים רחוקות על ידי מוטציות סרטניות בודדות 11. כך, תוכניות רבייה מורכבות נדרשות כדי ליצור GEM המותנה עם מוטציות שעור מרובות. יתר על כן, ייזום אסטרוציטומה מתרחש עם חדירות משתנים לאחר תקופת חביון ארוכה במודלים אלה, תוך התקדמות לastrocytomas בדרגה גבוהה בדרך כלל מתרחשת בלא אחידה, צורה אקראית וסופו של דבר מביאה לגידולים עם נופים הגנומי מורכבים וקינטיקה צמיחה מהירה 27, 28. החדירות משתנים והטבע סטוכסטיים של התקדמות ממארת בדגמי GEM מותנים דורשים כי עכברים בודדים שיוקרנו על ידי הדמיה רדיוגרפית כדי לזהות את הנוכחות ומיקום של astrocytomas בדרגה גבוהה לפני גיוסם בניסויים פרה קליניים בסמים. יחדיו, מגבלות אלה לעכב את הדור ובדיקה של הקבוצות הגדולות של GEM המותנה הנדרש ליחסי ציבורבדיקות סמים eclinical.

מערכת GEM RCAS-רשות עמק טנסי, אשר מנצלת retroviral עופות וקטורים (RCAS) להדביק GEM שהונדס קולט הנגיפי (רשות עמק טנסי) על סוגי תאים עצביים ספציפיים, נוצלה בהרחבה למודל יצירת גידולי אסטרוציטומה 11. בניגוד לGEM המותנה, מערכת מודל זה מאפשרת כניסתה של מוטציות סרטניות מרובות בסוגים ספציפיים תאים ללא דרישה לתוכניות רבייה מורכבות. עם זאת, הוא מוגבל על ידי חדירות משתנים, הדרישה לפעילה חלוקת תאים להשיג אינטגרציה נגיפית, וההחדרה האקראית של transgenes לתוך הגנום המארח 29.

מודלים GEM (nGEM) ללא בתאים מין, אשר מנצלים תאים שנקטפו מGEM, הם הופכים חשובים יותר ויותר, כי הם להתגבר על רב מהמגבלות של מערכות מודל אחרות 15. התפקיד של ייזום סוג תא ומוטציות שיתוף המתרחש בפתוגנזה אסטרוציטומה קשה להרתיעמכרה באמצעות הוקמה קווים אנושיים GBM תא או PDX כי הם נגזרים מגידולים בשלב סופי שהצטברו מוטציות גנטיות נרחבות בסוגים מוגדרים של תאים במהלך התפתחות ממארת. בניגוד לכך, כל הציונים של astrocytomas יכולים להיות מודל באמצעות nGEM ידי גרימה מוגדרת מוטציות גנטיות בתוך סוגי תאי המוח מטוהרים ספציפיים 11,30. לפיכך, ההשפעה של מוטציות גנטיות ספציפיות וסוג תא בפנוטיפים תאיים ומולקולריים ניתן לקבוע במבחנת in vivo. בדומה לשורות תאי GBM הוקמו אנושיות, במבחנה בדיקות סמים ראשוניות באמצעות nGEM יכולות לשמש כדי לתעדף תרופות לבדיקות במבחנה תוך שימוש באותם התאים. יצירת גידולים in vivo אז יכול להיות שנקבעו על ידי allografting תאי nGEM orthotopically למוחן של המלטת syngeneic חיסון מוסמכת 30. מודלים של שתל orthotopic אלה ולכן מאפשרים בבדיקת vivo לא רק של ציטוטוקסיות קונבנציונלייםnd ממוקד טיפולים, אבל חיסוני-modulatory וטיפולים ממוקדי סטרומה גם כן. לבסוף, תפקידה של microenvironment על התחלה של גידול והתקדמות יכול להיות נקבע על ידי השוואת תוצאות בין nGEM ודגמי GEM קונבנציונליים משתמשת באותו מוטציות באותו סוגי התאים.

אנו ואחרים פיתחו אסטרוציטומה nGEM באמצעות תאים ראשוניים – האסטרוציטים, המועצה לביטחון לאומי, או תאי אב oligodendrocyte (OPC) – שנקטפו מן GEM 30-34. הרציונל מאחורי הפיתוח של אסטרוציטומה nGEM היה ליצור מודל כדי לקבוע את ההשלכות פנוטיפי של מוטציות סרטניות בסוגי תאים מסוימים שעלולים לשמש לבדיקות סמים פרה קליניות במבחנת in vivo בבעלי החיים חיסון מוסמך. אנו נקטפנו האסטרוציטים phenotypically WT קליפת המוח ומועצה לביטחון לאומי שמאינו Cre להביע, GEM המותנה לקיים מ94% רקע C57 / BL6> עם מסלול RB floxed – RB1 loxP / loxP, או TgGZT121 – וfloxed מסלול RTK / RAS / PI3K – NF1 loxP / loxP, קראס G12D, PTEN loxP / loxP – גנים בשילובים שונים 35-39. אנו מושרה רקומבינציה הגנטית במבחנה באמצעות וקטורי adenoviral קידוד recombinase Cre. בגלל יבולי astrocyte קליפת המוח מכילים תערובת של סוגי תאים, השתמשנו וקטורי Ad5GFAPCre או transgenes שעור דומיננטי, כגון TgGZT 121 מונעים מאמרגן GFAP האנושי, להעשיר לGFAP + האסטרוציטים בקליפת המוח בתרבויות אלה. אנחנו הגדרנו את ההשלכות פנוטיפי של G 1 / S (Rb), MAPK, ומוטציות מסלול PI3K בהאסטרוציטים בקליפת המוח ומועצה לביטחון לאומית במבחנת in vivo. האסטרוציטים MAPK וG1-מופעל / PI3K S-פגום GBM מולקולרי חיקה אדם proneural ו, על הזרקת orthotopic, גידולים שנוצרו במיקום מוגדר מראש עם קינטיקה צמיחה אחידה, שיהוי קצר, והיסטופתולוגיותסימני ההיכר של בני אל 30 GBM. ניטור אורך של צמיחת גידול in vivo מסייע בדיקות סמים פרה קליניות דרך נורמליזציה של מחזורי טיפול וניתוח כמותי של צמיחת גידולים בתגובה לטיפול 40. אנחנו נקבע קינטיקה צמיחת גידול על ידי הדמיה פליטת אור אורך של עכברים שהוזרקו עם לוציפראז להביע האסטרוציטים בקליפת המוח. לכן, האסטרוציטים בקליפת המוח ומועצה לביטחון לאומי נגזרים מGEM המותנה לספק מערכת מודל צייתנית להגדרה של השלכות תפקודיות של המוטציות הקשורים אסטרוציטומה ומערכת מודל פוטנציאל לפיתוח תרופות פרה קליני.

Protocol

כל המחקרים בבעלי החיים אושרו על ידי אוניברסיטת צפון קרוליינה המוסדית הטיפול בבעלי חיים ועדת שימוש. .1 Culturing בקליפת מוח האסטרוציטים מעכברים בילוד הכנה <li style…

Representative Results

פיתחנו מערכת מודל nGEM עם האסטרוציטים בקליפת המוח ומועצה לביטחון לאומי שנקטפו מחסת GEM ילוד floxed אללים מותנים שבעור שיכול להיות מאופיין phenotypically במבחנת in vivo (איור 1). על מנת לחקור את ההשלכות של מוטציות סרטניות במיוחד בקליפת מוח האסטרוציטים במבחנה, זה קרי…

Discussion

שלבים הקריטיים ביותר כדי להבטיח קציר ותרבות של האסטרוציטים בקליפת המוח הם 1) ראויים שיחתכו את הקליפה מבלי לקחת רקמה מתחת לכפיס המוח, 2) כדי להסיר את קרומי המוח, 3) כדי לנתק באופן יסודי את התאים, ו4) להעשרה לGFAP + האסטרוציטים. למרות שאנו משמשים מכאנית (רעד) וגנטית (הגבל?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

CRM is a Damon Runyon-Genentech Clinical Investigator. This work was supported, in part, by grants to CRM from the Damon Runyon Cancer Research Foundation (CI-45-09), Department of Defense (W81XWH-09-2-0042), and University of North Carolina University Cancer Research Fund (UCRF). The authors wish to thank Daniel Roth for mouse husbandry assistance. The authors also wish to thank Hannah Chae, Carter McCormick, Demi Canoutas, Stephanie Gillette, and Susannah Krom for tissue culture and immunofluorescence assistance.

Materials

Name of Material/ Equipment Company Catalog Number Comments/Description
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) (1X) Invitrogen 11995065 DMEM can also be purchased from other suppliers including GIBCOSigma and Cellgro
Fetal Bovine Serum, Regular Cellgro 35-010-CV
Penicillin-Streptomycin Invitrogen 15140122
Sharp-Pointed Dissecting Scissors Fisher Scientific 08-395
Cartilage Thumb Forceps, Curved Fisher Scientific 1631
Miltex 17-301 Style 1 Jeweler Style Forceps, Fine, 4 Miltex 17-301
Ethanol (200 proof) Decon Labs 2710
Razor Blades VWR 55411-050
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) (1X), liquid Invitrogen 14175-095
TrypLE Express (1X), Phenol Red Invitrogen 12605-010 Other Trypsin solutions are also suitable for cortical astrocyte havest and culture
CULTURE DISH, 60 x 15 mm Thomas Scientific 9380H77
15 ml tubes BD Biosciences 352096
50 ml tubes BD Biosciences 352070
Adenovirus stock Gene Transfer Vector Core, U. Iowa Ad5CMVCre Store in 5 µl aliquots at -80 C. Hazardous.  Use Bsl2 safetyy  precautions
Sodium sulfate (Na2SO4)  Sigma-Aldrich 238597
Potassium sulfate (K2SO4) Sigma-Aldrich 221325
Magnesium chloride (MgCl2) Sigma-Aldrich M8266
Calcium chloride (CaCl2) Sigma-Aldrich 746495
HEPES potassium salt Sigma-Aldrich H0527
D-(+)- Glucose Sigma-Aldrich G8270 
Phenol Red Sigma-Aldrich P3532
Sodium hydroxide (NaOH) Sigma-Aldrich S5881
Papain Worthington LS003127
L-Cysteine-HCl Sigma-Aldrich C1276
Syringe filter (0.22 µm pore size) Millipore SLGP033NS
Neurocult proliferation kit, mouse Stemcell Technologies 5702 This kit contains the NeuroCult NSC Basal Medium and NeuroCult NSC supplement needed for NSC culture
0.2% Heparin solution Stemcell Technologies 7980
EGF  Invitrogen PMG8041
bFGF  Invitrogen PHG0261
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) (10X) Invitrogen 14185-052
Magnesium sulfate (MgSO4) Sigma-Aldrich M7506
Sodium bicarbonate (NaHCO3) Sigma-Aldrich S5761
E-64 Sigma-Aldrich E3132 Make 10 mM stock in DMSO, store at -20 °C
6-well plates Fisher Scientific 07-200-83
Cell strainer (40 µm pore size) Corning 352340
Stem cell dissociation solution Stemcell Technologies 5707 Alternatively, use gentle enzyme solutions such as Accutase
Methyl cellulose 15 cP Sigma-Aldrich M7027
Dulbecco's Modified Eagle's Media 2X Millipore SLM-202-B For making 5% methyl cellulose solution
1.7mL Snap Cap Microcentrifuge Tube Corning 3620
Hamilton syringe, 250 µl LT no needle Fisher Scientific 14-815-92
PB600-1 Antigen Dispenser Hamilton  83700
Disposable 18 ga needles  Fisher Scientific NC9015638 
27 ga 1/2" luer tip needle Fisher Scientific 14-826-48
2,2,2-Tribromoethanol (Avertin) Sigma-Aldrich T48402
Betadine Fisher Scientific NC9386574
Puralube Opthalmic Ointment Fisher Scientific NC9689910
 Model 900 Stereotaxic frame Kopf Instruments
VETBOND Fisher Scientific NC9259532  Tissue adhesive 
Lidocaine  ShopMedVet RXLIDO-EPI
CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay (MTS) Promega G3580
Anti-Sox2 Millipore AB5603
Polyclonal Rabbit Anti-Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP) Dako Z0334 
IVIS Kinetic PerkinElmer For in vivo imaging
D-Luciferin – K+ Salt Bioluminescent Substrate PerkinElmer 122796 For in vivo bioluminescence imaging
EdU Imaging Kit Invitrogen C10340
MSCV Luciferase PGK-hygro Addgene 18782
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Dolecek, T. A., Propp, J. M., Stroup, N. E., Kruchko, C. CBTRUS statistical report: primary brain and central nervous system tumors diagnosed in the United States in 2005-2009. Neuro Oncol. 14, 1-49 (2012).
  2. Stupp, R., et al. Radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma. New England Journal Of Medicine. 352 (10), 987-996 (2005).
  3. Giese, A., Bjerkvig, R., Berens, M. E., Westphal, M. Cost of migration: invasion of malignant gliomas and implications for treatment. J. Clin. Oncol. 21 (8), 1624-1636 (2003).
  4. Miller, C. R., Perry, A. Glioblastoma. Arch. Pathol. Lab. Med. 131 (3), 397-406 (2007).
  5. . Genome Atlas Research Network. Comprehensive genomic characterization defines human glioblastoma genes and core pathways. Nature. 455 (7216), 1061-1068 (2008).
  6. Verhaak, R. G., et al. Integrated genomic analysis identifies clinically relevant subtypes of glioblastoma characterized by abnormalities in PDGFRA, IDH1, EGFR, and NF1. Cancer Cell. 17 (1), 98-110 (2010).
  7. Brennan, C. W., et al. The somatic genomic landscape of glioblastoma. Cell. 155 (2), 462-477 (2013).
  8. Phillips, H. S., et al. Molecular subclasses of high-grade glioma predict prognosis, delineate a pattern of disease progression, and resemble stages in neurogenesis. Cancer Cell. 9 (3), 157-173 (2006).
  9. Vitucci, M., Hayes, D. N., Miller, C. R. Gene expression profiling of gliomas: merging genomic and histopathological classification for personalised therapy. Br. J. Cancer. 104 (4), 545-553 (2011).
  10. Sharpless, N. E., Depinho, R. A. The mighty mouse: genetically engineered mouse models in cancer drug development. Nat. Rev. Drug Discov. 5 (9), 741-754 (2006).
  11. Schmid, R. S., Vitucci, M., Miller, C. R. Genetically engineered mouse models of diffuse gliomas. Brain Res. Bull. 88 (1), 72-79 (2012).
  12. Siolas, D., Hannon, G. J. Patient-derived tumor xenografts: transforming clinical samples into mouse models. Cancer Res. 73 (17), 5315-5319 (2013).
  13. Sonoda, Y., et al. Formation of intracranial tumors by genetically modified human astrocytes defines four pathways critical in the development of human anaplastic astrocytoma. Cancer Res. 61 (13), 4956-4960 (2001).
  14. Mao, X. G., et al. LIN28A facilitates the transformation of human neural stem cells and promotes glioblastoma tumorigenesis through a pro-invasive genetic program. Oncotarget. 4 (7), 1050-1064 (2013).
  15. Heyer, J., Kwong, L. N., Lowe, S. W., Chin, L. Non-germline genetically engineered mouse models for translational cancer research. Nat. Rev. Cancer. 10 (7), 470-480 (2010).
  16. Miller, C. R., Williams, C. R., Buchsbaum, D. J., Gillespie, G. Y. Intratumoral 5-fluorouracil produced by cytosine deaminase/5-fluorocytosine gene therapy is effective for experimental human glioblastomas. Cancer Res. 62 (3), 773-780 (2002).
  17. Becher, O. J., Holland, E. C. Genetically engineered models have advantages over xenografts for preclinical studies. Cancer Res. 66 (7), 3355-3358 (2006).
  18. Huse, J. T., Holland, E. C. Genetically engineered mouse models of brain cancer and the promise of preclinical testing. Brain Pathol. 19 (1), 132-143 (2009).
  19. Lee, J., et al. Tumor stem cells derived from glioblastomas cultured in bFGF and EGF more closely mirror the phenotype and genotype of primary tumors than do serum-cultured cell lines. Cancer Cell. 9 (5), 391-403 (2006).
  20. Li, A., et al. Genomic changes and gene expression profiles reveal that established glioma cell lines are poorly representative of primary human gliomas. Mol. Cancer Res. 6 (1), 21-30 (2008).
  21. Vries, N. A., Beijnen, J. H., van Tellingen, O. High-grade glioma mouse models and their applicability for preclinical testing. Cancer Treat. Rev. 35 (8), 714-723 (2009).
  22. Clark, M. J., et al. U87MG decoded: the genomic sequence of a cytogenetically aberrant human cancer cell line. PLoS Genet. 6 (1), (2010).
  23. Carvalho, A. C., et al. Gliosarcoma stem cells undergo glial and mesenchymal differentiation in vivo. Stem Cells. 28 (2), 181-190 (2010).
  24. Yost, S. E., et al. High-resolution mutational profiling suggests the genetic validity of glioblastoma patient-derived pre-clinical models. PLoS One. 8 (2), (2013).
  25. Giannini, C., et al. Patient tumor EGFR and PDGFRA gene amplifications retained in an invasive intracranial xenograft model of glioblastoma multiforme. Neuro Oncol. 7 (2), 164-176 (2005).
  26. Rich, J. N., Guo, C., McLendon, R. E., Bigner, D. D., Wang, X. F., Counter, C. M. A genetically tractable model of human glioma formation. Cancer Res. 61 (9), 3556-3560 (2001).
  27. Chow, L. M., et al. Cooperativity within and among Pten, p53, and Rb pathways induces high-grade astrocytoma in adult brain. Cancer Cell. 19 (3), 305-316 (2011).
  28. Song, Y., et al. Evolutionary etiology of high-grade astrocytomas. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. , (2013).
  29. Werder, A., Seidler, B., Schmid, R. M., Schneider, G., Saur, D. Production of avian retroviruses and tissue-specific somatic retroviral gene transfer in vivo using the RCAS/TVA system. Nat. Protoc. 7 (6), 1167-1183 (2012).
  30. Vitucci, M., et al. Cooperativity between MAPK and PI3K signaling activation is required for glioblastoma pathogenesis. Neuro Oncol. 15 (10), 1317-1329 (2013).
  31. Yahanda, A. M., Bruner, J. M., Donehower, L. A., Morrison, R. S. Astrocytes derived from p53-deficient mice provide a multistep in vitro model for development of malignant gliomas. Mol. Cell. Biol. 15 (8), 4249-4259 (1995).
  32. McEllin, B., et al. PTEN loss compromises homologous recombination repair in astrocytes: implications for glioblastoma therapy with temozolomide or poly(ADP-ribose) polymerase inhibitors. Cancer Res. 70 (13), 5457-5464 (2010).
  33. Kim, H. S., et al. Gliomagenesis arising from Pten- and Ink4a/Arf-deficient neural progenitor cells is mediated by the p53-Fbxw7/Cdc4 pathway, which controls c-Myc. Cancer Res. 72 (22), 6065-6075 (2012).
  34. Radke, J., Bortolussi, G., Pagenstecher, A. Akt and c-Myc induce stem-cell markers in mature primary p53(-)/(-) astrocytes and render these cells gliomagenic in the brain of immunocompetent mice. PLoS One. 8 (2), (2013).
  35. Marino, S., Vooijs, M., Der Gulden, H. v. a. n., Jonkers, J., Berns, A. Induction of medulloblastomas in p53-null mutant mice by somatic inactivation of Rb in the external granular layer cells of the cerebellum. Genes Dev. 14 (8), 994-1004 (2000).
  36. Zhu, Y., et al. Ablation of NF1 function in neurons induces abnormal development of cerebral cortex and reactive gliosis in the brain. Genes Dev. 15 (7), 859-876 (2001).
  37. Jackson, E. L., et al. Analysis of lung tumor initiation and progression using conditional expression of oncogenic K-ras. Genes Dev. 15 (24), 3243-3248 (2001).
  38. Xiao, A., Wu, H., Pandolfi, P. P., Louis, D. N., Van Dyke, T. Astrocyte inactivation of the pRb pathway predisposes mice to malignant astrocytoma development that is accelerated by PTEN mutation. Cancer Cell. 1 (2), 157-168 (2002).
  39. Xiao, A., Yin, C., Yang, C., Di Cristofano, A., Pandolfi, P. P., Van Dyke, T. Somatic induction of Pten loss in a preclinical astrocytoma model reveals major roles in disease progression and avenues for target discovery and validation. Cancer Res. 65 (12), 5172-5180 (2005).
  40. Neill, K., Lyons, S. K., Gallagher, W. M., Curran, K. M., Byrne, A. T. Bioluminescent imaging: a critical tool in pre-clinical oncology research. J. Pathol. 220 (3), 317-327 (2010).
  41. McCarthy, K. D., de Vellis, J. Preparation of separate astroglial and oligodendroglial cell cultures from rat cerebral tissue. J. Cell Biol. 85 (3), 890-902 (1980).
  42. Azari, H., Sharififar, S., Rahman, M., Ansari, S., Reynolds, B. A. Establishing embryonic mouse neural stem cell culture using the neurosphere assay. J. Vis. Exp. (47), (2011).
  43. Giulian, D., Baker, T. J. Characterization of ameboid microglia isolated from developing mammalian brain. J. Neurosci. 6 (8), 2163-2178 (1986).
  44. Franken, N. A., Rodermond, H. M., Stap, J., Haveman, J., van Bree, C. Clonogenic assay of cells in vitro. Nat. Protoc. 1 (5), 2315-2319 (2006).
  45. Miller, C. R., Bash, R. E., Vitucci, M., White, K. K. A genetically-defined, orthotopic allograft model system of glioblastoma: Pathological features and experimental therapeutics. J. Neuropathol. Exp. Neurol. 69 (5), 522 (2011).
  46. Bash, R., et al. Concurrent temozolomide-external beam radiation therapy is effective for experimental glioblastomas in an orthotopic, genetically engineered syngeneic mouse allograft model system. Neuro Oncol. 11 (5), 638 (2009).
  47. Hamby, M. E., Uliasz, T. F., Hewett, S. J., Hewett, J. A. Characterization of an improved procedure for the removal of microglia from confluent monolayers of primary astrocytes. J. Neurosci. Meth. 150 (1), 128-137 (2006).
  48. Cahoy, J. D., et al. A transcriptome database for astrocytes, neurons, and oligodendrocytes: a new resource for understanding brain development and function. J. Neurosci. 28 (1), 264-278 (2008).
  49. Foo, L. C., et al. Development of a method for the purification and culture of rodent astrocytes. Neuron. 71 (5), 799-811 (2011).
  50. Rietze, R. L., Valcanis, H., Brooker, G. F., Thomas, T., Voss, A. K., Bartlett, P. F. Purification of a pluripotent neural stem cell from the adult mouse brain. Nature. 412 (6848), 736-739 (2001).
  51. Campisi, J. Aging, cellular senescence, and cancer. Annu. Rev. Physiol. 75, 685-705 (2013).
  52. Sirko, S., et al. Reactive glia in the injured brain acquire stem cell properties in response to sonic hedgehog. Cell stem cell. 12 (4), 426-439 (2013).
  53. Robel, S., Berninger, B., Gotz, M. The stem cell potential of glia: lessons from reactive gliosis. Nat. Rev. Neurosci. 12 (2), 88-104 (2011).
  54. Burrell, K., Agnihotri, S., Leung, M., Dacosta, R., Hill, R., Zadeh, G. A novel high-resolution in vivo imaging technique to study the dynamic response of intracranial structures to tumor growth and therapeutics. J. Vis Exp. e50363 (76), (2013).
  55. Sottoriva, A., et al. Intratumor heterogeneity in human glioblastoma reflects cancer evolutionary dynamics. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110 (10), 4009-4014 (2013).
  56. Snuderl, M., et al. Mosaic amplification of multiple receptor tyrosine kinase genes in glioblastoma. Cancer Cell. 20 (6), 810-817 (2011).

Tags

AstrocytomaGlioblastomaCortical AstrocytesNeural Stem CellsConditional Genetically Engineered MiceOncogenic MutationsTumor Suppressor GenesIn Vitro TransformationOrthotopic AllograftsBioluminescence ImagingPreclinical Drug Development
check_url/kr/51763?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
McNeill, R. S., Schmid, R. S., Bash, R. E., Vitucci, M., White, K. K., Werneke, A. M., Constance, B. H., Huff, B., Miller, C. R. Modeling Astrocytoma Pathogenesis In Vitro and In Vivo Using Cortical Astrocytes or Neural Stem Cells from Conditional, Genetically Engineered Mice. J. Vis. Exp. (90), e51763, doi:10.3791/51763 (2014).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image