Zinc-finger nucleases Gene maior focalização em células estaminais embrionárias humanas
Summary
Linhas celulares Repórter oferecer um meio de visualizar, monitorar e isolar as células de interesse de populações heterogêneas. No entanto, utilizando a recombinação homóloga convencional em células estaminais embrionárias humanas-alvo do gene é extremamente ineficiente. Relata-se alvo CNS mesencéfalo específico fator de transcrição PITX3 loco com EGFP usando zinc-finger nuclease reforçada recombinação homóloga.
Abstract
Uma grande limitação com células-tronco embrionárias (ESC) protocolos de diferenciação atuais é a geração de populações de células heterogêneas. Estas culturas contêm as células de interesse, mas também estão contaminados com CES indiferenciadas, derivados não-neuronais e outros subtipos neuronais. Isto limita a sua utilização in vitro e in vivo em aplicações, tais como em modelagem vitro para a descoberta de drogas ou terapia de substituição de células. Para ajudar a superar isso, linhas de células repórter, que oferecem um meio de visualizar, monitorar e isolar as células de interesse, podem ser projetados. No entanto, para alcançar este objectivo em células-tronco embrionárias humanas por meio de recombinação homóloga convencional é extremamente ineficiente. Este protocolo descreve a segmentação do homeobox Hipófise 3 (PITX3) lugar em células estaminais embrionárias humanas usando nucleases zinc-finger projetados, que introduzem quebras de DNA de cadeia dupla específicas do local, juntamente com umaPITX3 – EGFP -específico vector dador de DNA. Após a geração da linha celular PITX3 repórter, que podem então ser diferenciadas usando protocolos publicados para a utilização em estudos in vitro, tais como a doença ou modelos de substituição de células terapia de Parkinson.
Introduction
Current células estaminais embrionárias (ESC) protocolos de diferenciação resultar em populações celulares heterogéneas, em particular no que diz respeito à determinação de fenótipos neuronais específicas. Assim, embora as culturas contêm o fenótipo celular desejado, outro neuronal, tipos de células não-neuronais e não-diferenciados estão freqüentemente presentes 1. Estas características de limitar a aplicação da CES derivado de fontes celulares para utilização na terapia de substituição de células e em modelos in vitro da doença.
Linhas de células repórteres genéticos oferecer um meio para visualizar, rastrear e isolar as células de interesse, desde que a expressão da proteína repórter (RP) reproduz expressão endógena. A utilização de promotores imediatamente a montante de uma região codificante do gene podem ser utilizados para derivar os repórteres genéticos bruto mas tais construções não possuem os elementos reguladores que controlam a expressão precisos gene endógeno. Em contraste, a recombinação homóloga ofereceoportunidade de assegurar a expressão de alta fidelidade da RP. No passado, os vectores de direccionamento concebidos para a recombinação homóloga no locus específico de interesse foram utilizados para direccionar RPS em rato (CES mESCs) utilizando electroporação, como um meio de entrega de ADN de 1,2. No entanto, a geração de linhas de células repórteres via recombinação homóloga convencional é extremamente ineficiente para humanos (CES hESCs), e, assim, só tem sido documentada em diversos casos (revista em 3). Ao utilizar uma proteína quimérica engenharia contendo uma fusão de uma nuclease Fok I com motivos de dedos de zinco específicas do local, conhecidos colectivamente como nucleases de dedos de zinco (ZFNs), quebras de ADN de cadeia dupla pode ser introduzida no locus genómico pre-determinado. Quando um vector de ADN com homologia com ambos os lados da ruptura de DNA de cadeia dupla é adicionado, o sítio genómico pode ser reparada por recombinação homóloga, permitindo a incorporação da sequência de ADN dador. Esta técnica provou ser útil fou edição genômica em células primárias humanas 4,5 e 6,7 hESCs. Trabalhos mais recentes tem utilizados activadores de transcrição, como efectoras nucleases (TALENS), factores de transcrição utilizadas por agentes patogénicos 8, para auxiliar na criação de site-specific nucleases 9.
No seguinte protocolo que demonstram a geração de uma linha celular de células estaminais embrionárias humanas repórter por electroporação de um vector de EGFP contendo homólogo direccionamento 6 em conjunto com ZFNs para a homeobox pituitária humana 3 (PITX3) local. Após a seleção de antibióticos por 2-3 semanas, hESCs com DNA corretamente integrado pode ser escolhido manualmente, expandiu e selecionados, inicialmente, via PCR, e posteriormente validada por Southern blotting.
Protocol
Representative Results
Discussion
A geração de linhas celulares repórter oferece um meio poderoso para rastrear, visualizar e isolar as células de interesse de uma população heterogênea derivado de hESCs. No entanto, a abordagem selectiva de genes através de recombinação homóloga convencional provou ser extremamente ineficiente para o CES humanos 3. Neste protocolo, descrevem uma técnica relativamente simples para a introdução de uma RP para um exão do locus PITX3, em hESCs utilizando um vector de direccionamento ampla…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Trabalho descrito neste protocolo foi possível graças ao financiamento do Governo de Victoria, como parte de uma aliança de colaboração com o Instituto de Medicina Regenerativa da Califórnia (CIRM).
Materials
| Mouse Embryonic Fibroblasts (DR4) | GlobalStem | GSC-6004G | |
| Gelatin | Sigma | G1393-100ML | |
| HBSS, no Calcium, no Magnesium, no Phenol Red (HBSS) | Life Technologies | 14175-095 | |
| Dispase | StemCell Technologies | 7923 | |
| Cell Scraper | Corning | 3008 | |
| Accutase | Life Technologies | A11105-01 | |
| Y27632 | Axon Medchem | Axon 1683 | |
| Cell Strainer – 40um | BD Biosciences | 352340 | |
| 33mm – 0.22 um filter | Millipore | SLGP033RS | |
| rhFGF2 | R&D Systems | 233-FB-025/CF | |
| Electroporator | BioRad | 165-2661 | |
| 0.4cm electroporation cuvette | BioRad | 165-2088 | |
| Human TV-hPITX3-forward targeting construct | Addgene | 31942 | |
| ZFN Kit; Human PITX3 | Sigma-Aldrich | CKOZFN1050-1KT | |
| Puromycin | Invivogen | ant-pr-1 | |
| Matrigel | BD Biosciences | 354277 | |
| Geltrex | Life Technologies | A1569601 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Life Technologies | 10566-016 | |
| Fetal Bovine Serum, Qualified, Heat Inactivated, US Origin (FBS) | Life Technologies | 16140-071 | |
| Pen/Strep | Life Technologies | 15070-063 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12) | Life Technologies | 11320-033 | |
| KnockOut Serum Replacement (KSR) | Life Technologies | 10828-028 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids (NEAA) | Life Technologies | 11140-050 | |
| GlutaMAX | Life Technologies | 35050-061 | |
| ß-mercaptoethanol | Life Technologies | 21985-023 | |
| N-Lauroylsarcosine sodium salt solution (Sarcosyl) (30%) | Sigma-Aldrich | 61747 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 | |
| Trizma Hydrochloride | Sigma-Aldrich | T3253 | |
| Proteinase K solution (20mg/ml) | Bioline Australia | BIO-37084 | |
| Expand Long Template PCR System | Roche Australia | 11681834001 | |
| hPITX3 L arm gen. F (primer): 5’ TGTCCTAAGGAGAATGGGTAACAGACA 3’ | GeneWorks, Australia | ||
| hPITX3 L arm GFP R (primer): 5’ ACACGCTGAACTTGTGGCCGTTTA 3’ | GeneWorks, Australia | ||
| HyperLadder 1kb | Bioline Australia | BIO-33025 | |
| GelRed | Jomar Bioscience, Australia | 41003 |
References
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