Leukocytter krydser endotelmonolaget hjælp den paracellulære eller transcellulær vej. Vi udviklede en simpel analyse at følge fordelingen af endogent forbindelsesepitop VE-cadherin og PECAM-1 under leukocyt transendotel migration under fysiologiske flow til at skelne mellem de to sjælevandring ruter.
Under betændelse, leukocytter forlade cirkulation og krydse endotel at bekæmpe invaderende patogener i underliggende væv. Denne proces er kendt som leukocyt transendotel migration. To ruter for leukocytter til at krydse den endotele monolag er blevet beskrevet: den paracellulære rute, dvs gennem celle-celle kryds og transcellulær vej, dvs gennem endotelcelle kroppen. Det har imidlertid været teknisk vanskeligt at skelne mellem stk og transcellulær rute. Vi har udviklet en enkel in vitro-assay til at undersøge fordelingen af endogent VE-cadherin og PECAM-1 i neutrofil transendothel migrering under fysiologiske flow betingelser. Forud for neutrofil perfusion blev endotelceller behandles kortvarigt med fluorescens-mærkede antistoffer mod VE-cadherin og PECAM-1. Disse antistoffer ikke forstyrre funktionen af begge proteiner, som blev bestemt ved elektrisk celle-substraTe impedansfølende FRAP målingerne. Ved hjælp af denne analyse, var vi i stand til at følge fordelingen af endogent VE-cadherin og PECAM-1 under transendothelial migration under strømning og skelne mellem de para- og transcellulær trækruter af leukocytter på tværs af endotel.
Effektiv og stramt kontrolleret leukocyt transendotel migration (TEM) er af afgørende betydning i fysiologiske processer, såsom immun overvågning og akut inflammation. Under visse patofysiologiske betingelser, ukontrolleret og overdreven TEM observeres resulterer i kroniske inflammatoriske sygdomme (fx rheumatoid arthritis, atherosklerose, astma). Også under tumorcellemetastase, processen transendothelial migration er afgørende for tumorceller at forlade kredsløbet til at metastasere 1-3. For specifikt at gribe ind med overdreven leukocyt eller tumor celle TEM er en detaljeret forståelse af reguleringen af denne proces kræves.
Det menes, at TEM proces sker gennem forskellige trin. Skelsættende undersøgelser, revideret to årtier siden af Butcher og Springer, førte til flertrins model, der beskriver processen med TEM 4,5. Denne model gælder stadig, selv om nogle annonceBetingede trin er medtaget 6. Alon et al. Beskrevet behovet for tilstedeværelsen af immobiliserede chemokiner på overfladen af endothelet 7. For nylig, viste de, at endotel selv genererer kemokiner, som præsenteres på endotel apikale overflade 8. Desuden den samme gruppe fremsat betydningen af strømningsforhold under TEM 7. For nylig, kan flere publikationer, der fokuserer på de to forskellige ruter leukocytter tage på det endelige diapedesis etape af TEM. De kan enten gå via celle-celle vejkryds, dvs ruten paracellulære migration, eller krydse gennem endothelcelle kroppen, kendt som transcellulær trækrute 9. Carman og kolleger studerede disse veje i detaljer og konkluderede, at leukocytter fortrinsvis vælger paracellulære trækrute (90%) over transcellulær rute (10%), når de passerer en navlestrengsvenen endotelmonolaget 10.Men når endotelceller fra andre kilder blev anvendt, fx hjernen eller mikrovaskulaturen flere leukocytter anvendes transcellulær vej (30%) 11. Den Vestweber gruppe viste for nylig, at når celle-celle kryds var i stand til at adskille fra hinanden ved hjælp af en knock-in-dyremodel, der erstatter endogene VE-cadherin for VE-cadherin-alpha-catenin kimæren blev leukocyt TEM fuldt blokeret 12 . Overraskende forfatterne bemærkede, at TEM blev blokeret i flere, men ikke alle, væv. Samlet set har disse elegante eksperimenter indikerede, at leukocytter foretrak paracellulære rute over transcellulær rute, selv om de regulatoriske signaler, der udløser denne beslutning, er stadig ukendt.
Selv om de fleste af leukocytterne foretrækker ruten paracellulære migration, er det stadig svært at skelne mellem de to veje. Hertil kommer, at, på trods af flere undersøgelser, der fokuserer på den rolle, endotelcelle-celle-junctioner, dynamikken i disse vejkryds, især forbindelsemotiver proteiner VE-cadherin og PECAM-1, i løbet af leukocyt overfarten er stadig under debat. Vi har udviklet en forholdsvis enkel assay, hvor disse junction molekyler kan monitoreres i realtid under leukocyt diapedese under fysiologiske flow betingelser under anvendelse af fluorescens-mærkede antistoffer. Disse antistoffer ikke forstyrre eller blokere forbindelsesepitop integritet eller mobiliteten af de målrettede proteiner. Dette assay giver os mulighed for at følge dynamikken af forbindelsesepitoper proteiner under processen af paracellulær TEM. Derudover denne analyse giver også skelne mellem para- og transcellulær trækruter.
Til denne protokol, er det afgørende at forhindre dannelsen af luftbobler i strømmen-kamre, da dette vil resultere i celle apoptose og en forstyrret monolag. For at undgå dette, vil vi gerne understrege at betale særlig interesse for trin 4.2 og 4.5, hvor rørene er forbundet til strøm-kammer. Et andet kritisk trin i protokollen er den priming af PMN'er, der holdes ved RT ved at inkubere dem i 15-30 min ved 37 ° C, inden injektion dem til strømmen-kammer (trin 4.1). Dette resulterer i priming af leukocyt integriner, tillader dem at holde sig til adhæsionsmolekyler, såsom ICAM-1 eller VCAM-1 på endotel.
Denne protokol er ikke begrænset til at undersøge transmigration neutrofiler. Også andre leukocyt typer såsom monocytter eller lymfocytter kan anvendes. Bemærk, at trin 4.1, dvs priming leukocytterne kan variere mellem leukocyt-typer. Der kan også anvendes andre typer af endotelceller. Til dette er det fortsat kritiskat stimulere endotelceller med passende inflammatoriske stimuli, såsom TNF-α eller IL-1β. Hvis neutrofiler ikke reagerer i transmigrating, kan man overveje behandling af neutrofiler kortvarigt (5 min) med N-formyl-L-methionyl-L-leucyl-L-phenylalanin (fMLP) peptid 16. Det vil stimulere neutrofiler, navnlig deres integriner, endnu mere, hvilket gør dem mere tilbøjelige til at holde sig til endotel.
Typisk 1 dyn / cm 2 flow-hastighed bruges. Dette flow hastighed er målt i post-kapillære venuler, steder hvor de fleste leukocyt transendotel migration opstår 17. Ved hjælp af de beskrevne flow-kamrene, er det muligt at øge strømningshastigheden op til 10 dyn / cm 2. Imidlertid er det ikke anbefales at forøge forskydning yderligere. Det kan resultere i uønsket lækage af slangen og frigørelse af cellerne fra flowet-kammer.
De i figur 3 resultater viser, at disseantistoffer kan anvendes til at visualisere og studere dynamikken i endotel celle-celle kryds under leukocyt diapedesis. Især i tillæg til de eksisterende transmigration assays denne protokol gør det muligt at skelne paracellulær fra transcellulær migrering under fysiologiske flow betingelser i realtid. Da antistofferne plette celle-celle kryds, kan man score det antal leukocytter, der krydser ve-cadherin / PECAM-1-positive kryds versus nonpositive VE-cadherin / PECAM-1 steder. Denne måde, transcellulær migration kan skelnes fra paracellulær indvandring.
Det er vigtigt at understrege, at disse antistoffer ikke forstyrrer funktionen af de proteiner, de binder til: den PECAM-1 antistof, der anvendes i denne undersøgelse er rettet mod det andet ekstracellulære domæne. Endotelceller, der var udpladet i nærvær af antistoffet ikke viser nogen fejl i at sprede eller dannelse af et monolag, hvilket tyder på, at antistoffet mindst ikkeforstyrre homotypiske interaktioner mellem endotelceller. i tillæg til det, gør begge antistoffer ikke påvirke evnen af neutrofiler til at migrere gennem endotelmonolaget. Derudover er antallet af neutrofiler, der der vandrer på tværs af endotelmonolaget i fravær eller nærvær af antistofferne ikke ændret (data ikke vist). Vigtigere, konfokal laserscanning mikroskopi giver os mulighed for at registrere forskellige fluorescerende kanaler og DIC samtidigt.
Således dette assay tillader at studere dynamikken i VE-cadherin og PECAM-1 på samme tid, når en neutrofil krydser endotelcelle-celle krydset og vil hjælpe til at forstå, hvorfor leukocytter vælge en rute over den anden, dvs paracellulær versus transcellulær.
The authors have nothing to disclose.
The authors thank Dr. P.L. Hordijk for critically reading the manuscript. AED is supported by a Landsteiner Foundation for Blood Transfusion Research (LSBR) fellowship (grant #1028). JK is supported by the Dutch Heart Foundation (2005T3901). JDvB is a NHS Dekker fellow (grant #2005T039).
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description | |
μ-Slide VI | IBIDI | 80606 | Flow-chamber | |
0.45 μm filter | Whatman/GE Lifesciences | 10462100 | ||
1 mL syringe | BD Plastipak | 300013 | ||
20 mL syringe | BD Discardit II | 366296 | ||
21G needle | BD Microlance | 301155 | ||
Albumin | Sanquin | 15522644 | ||
Ammunium chloride (NH4Cl) | Merck | 1009245000 | ||
Calcium chloride (CaCl2) | Sigma-Aldrich | 449709 | ||
EBM-2 Basal medium + EGM-2 SingleQuot Kit Suppl. & Growth Factors | Lonza | CC-3156 + CC-4176 | media | |
EDTA (Titriplex III) | Merck | 1370041000 | ||
Falcon tubes | Corning Life Sciences | 352096 | ||
Fibronectin | Sigma-Aldrich | F1141-2MG | FN | |
Glucose | Sigma-Aldrich | G7528 | ||
HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | ||
In-line Luer Injection port | IBIDI | 10820 | ||
Magnesium sulfate heptahydrate (MgSO4.7H2O) | Merck | 105886 | ||
PECAM-1-ALEXA-647 | BD Pharmingen | 561654 | clone WM59 stock concentration 0.1mg/mL |
|
Percoll | GE Healthcare Life Sciences | 17-0891-09 | ||
Phosphate Buffered Saline | Fresenius Kabi Nederland | M090001/01NL | PBS | |
Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P9541 | ||
Potassium hydrogen carbonate (KHCO3) | Merck | 1048540500 | ||
Potassium phosphate dibasic trihydrate (K2HPO4) | Sigma-Aldrich | P5504 | ||
Silicone Tygon 3350 tubing | VWR | 228-4331 | tubing | |
Sodium chloride (NaCl) | Calbiochem (Millipore) | 567441 | ||
Syringe pump | Harvard Apparatus | model number 55-5920 | ||
TNFα | Peprotech | 300-01A | tumor necrosis factor | |
trisodium citrate | Merck | 1.06447.5000 | TNC | |
Vacuettes | Greiner, Germany | 980044 | ||
VE-Cadherin-FITC | BD Pharmingen | 560411 | clone 55-7H1 | stock concentration 0.5mg/mL |
Zeiss LSM510 META | Carl Zeiss MicroImaging, Jena, Germany | |||
Zen Software 2008 | Carl Zeiss MicroImaging, Jena, Germany |