Leukocytes paracellular या transcellular मार्ग का उपयोग endothelial monolayer पार. हम अंतर्जात junctional का वितरण VE-cadherin और PECAM -1 ल्युकोसैट transendothelial प्रवास के दौरान शारीरिक प्रवाह के तहत दो स्थानांतरगमन मार्गों के बीच भेदभाव करने का पालन करने के लिए एक सरल परख का विकास किया.
सूजन के दौरान, leukocytes परिसंचरण छोड़ और अंतर्निहित ऊतकों में रोगजनकों हमलावर से लड़ने के लिए अन्तःचूचुक पार. इस प्रक्रिया ल्युकोसैट transendothelial प्रवास के रूप में जाना जाता है. Endothelial monolayer पार करने leukocytes के लिए दो मार्गों में वर्णित किया गया है: यानी सेल सेल जंक्शनों और transcellular मार्ग, के माध्यम से paracellular मार्ग, यानी, endothelial सेल शरीर के माध्यम से. हालांकि, यह पैरा और transcellular मार्ग के बीच विभेद करने के लिए तकनीकी रूप से कठिन रहा है. हम अंतर्जात का वितरण VE-cadherin और PECAM -1 शारीरिक प्रवाह परिस्थितियों में न्युट्रोफिल transendothelial प्रवास के दौरान अध्ययन करने के लिए एक सरल इन विट्रो परख का विकास किया. न्युट्रोफिल छिड़काव करने से पहले, endothelial कोशिकाओं संक्षिप्त VE-cadherin और PECAM-1 के खिलाफ fluorescently लेबल एंटीबॉडी के साथ इलाज किया गया. विद्युत सेल substra द्वारा निर्धारित किया गया था के रूप में ये एंटीबॉडी, दोनों प्रोटीन के समारोह के साथ हस्तक्षेप नहीं कियाते प्रतिबाधा संवेदन और FRAP माप. इस परख का उपयोग करना, हम अंतर्जात का वितरण प्रवाह शर्तों के तहत transendothelial प्रवास के दौरान और PECAM-1-cadherin VE और अन्तःचूचुक भर leukocytes के पैरा और transcellular प्रवास मार्गों के बीच भेदभाव का पालन करने में सक्षम थे.
कुशल और कसकर नियंत्रित ल्युकोसैट transendothelial माइग्रेशन (मंदिर) इस तरह के प्रतिरक्षा निगरानी और तीव्र सूजन के रूप में शारीरिक प्रक्रियाओं में महत्वपूर्ण महत्व का है. हालांकि, कुछ Patho शारीरिक शर्तों के तहत, अनियंत्रित और अत्यधिक मंदिर जीर्ण सूजन रोगों (जैसे, रुमेटी गठिया, atherosclerosis, अस्थमा) में जिसके परिणामस्वरूप मनाया जाता है. ट्यूमर कोशिकाओं को 1-3 metastasize को प्रचलन छोड़ने के लिए भी ट्यूमर सेल मेटास्टेसिस के दौरान, transendothelial प्रवास की प्रक्रिया महत्वपूर्ण भूमिका निभाई है. विशेष रूप से अत्यधिक ल्युकोसैट या ट्यूमर सेल मंदिर के साथ हस्तक्षेप करने के लिए, इस प्रक्रिया के विनियमन की एक विस्तृत समझ की आवश्यकता है.
यह मंदिर प्रक्रिया विभिन्न चरणों के माध्यम से होता है कि माना जाता है. कसाई और स्प्रिंगर ने दो दशक पहले की समीक्षा की मौलिक अध्ययन, मंदिर 4,5 की प्रक्रिया का वर्णन multistep मॉडल का नेतृत्व किया. यह मॉडल अभी भी कुछ विज्ञापन हालांकि, सच हैपारंपरिक चरणों 6 शामिल किया गया है. Alon एट अल. अन्तःचूचुक 7 की सतह पर स्थिर chemokines की उपस्थिति के लिए जरूरत का वर्णन किया. हाल ही में, वे अन्तःचूचुक ही endothelial शिखर सतह 8 में प्रस्तुत कर रहे हैं जो chemokines उत्पन्न करता है कि पता चला है. इसके अलावा, एक ही समूह के मंदिर 7 दौरान प्रवाह की स्थिति के महत्व पर बल दिया. हाल ही में, दो अलग अलग मार्गों leukocytes पर केंद्रित कई प्रकाशनों मंदिर की अंतिम diapedesis स्तर पर ले जा सकते हैं. वे, यानी, सेल सेल जंक्शनों के माध्यम से paracellular माइग्रेशन मार्ग जाना, या transcellular माइग्रेशन मार्ग 9 के रूप में जाना endothelial सेल शरीर के माध्यम से पार कर सकते हैं या तो. गाड़ीवान और उनके सहयोगियों ने विस्तार से इन रास्ते का अध्ययन किया और एक नाल की नस endothelial monolayer 10 पार कर जब leukocytes preferentially transcellular मार्ग (10%) से अधिक paracellular माइग्रेशन मार्ग (90%) का चयन संपन्न हुआ.हालांकि, अन्य मूल से endothelial कोशिकाओं का उपयोग किया गया है जब, जैसे, मस्तिष्क या microvasculature, अधिक leukocytes transcellular मार्ग (30%) 11 का इस्तेमाल किया. एक VE-cadherin-अल्फा catenin के लिए कल्पना Vestweber समूह ने हाल ही में सेल सेल जंक्शनों अंतर्जात की जगह, एक दस्तक में पशु मॉडल का उपयोग करके एक दूसरे से अलग कर देना करने में असमर्थ थे जब कि VE-cadherin दिखाया, ल्युकोसैट मंदिर पूरी तरह से 12 ब्लॉक किया गया था . हैरानी की बात है, लेखकों मंदिर कई में अवरुद्ध है, लेकिन सभी नहीं, ऊतकों था कि देखा. कुल मिलाकर, इन सुरुचिपूर्ण प्रयोगों इस निर्णय को ट्रिगर कि नियामक संकेत अभी भी अज्ञात है, हालांकि leukocytes, transcellular मार्ग पर paracellular मार्ग वरीय कि संकेत दिया.
Leukocytes के बहुमत paracellular प्रवास मार्ग को पसंद करते हैं, भले ही यह दोनों रास्ते के बीच विभेद करने के लिए अभी भी मुश्किल है. Endothelial सेल सेल junct की भूमिका पर ध्यान केंद्रित कई अध्ययनों के बावजूद कि के अलावा,आयनों, इन जंक्शनों की गतिशीलता, विशेष रूप से junctional प्रोटीन VE-cadherin और PECAM -1, ल्युकोसैट पार बहस के तहत अब भी है के दौरान. हम इन जंक्शन अणुओं fluorescently लेबल एंटीबॉडी का उपयोग शारीरिक प्रवाह परिस्थितियों में ल्युकोसैट diapedesis दौरान वास्तविक समय में निगरानी रखी जा सकता है जिसमें एक अपेक्षाकृत सरल परख का विकास किया. ये एंटीबॉडी के साथ हस्तक्षेप या लक्षित प्रोटीन की junctional अखंडता या गतिशीलता को ब्लॉक नहीं किया. इस परख हमें paracellular मंदिर की प्रक्रिया के दौरान junctional प्रोटीन की गतिशीलता का पालन करने की अनुमति देता है. साथ ही, यह परख भी पैरा और transcellular प्रवास मार्गों के बीच भेदभाव की अनुमति देता है.
इस सेल apoptosis और एक बाधित monolayer में परिणाम होगा क्योंकि इस प्रोटोकॉल के लिए, यह प्रवाह कोठरियों में हवा के बुलबुले के गठन को रोकने के लिए महत्वपूर्ण है. इससे बचने के लिए, हम ट्यूब प्रवाह चैम्बर से जुड़े हैं, जहां कदम 4.2 और 4.5, विशेष रूप से ब्याज का भुगतान करने के लिए तनाव की कामना करते हैं. प्रोटोकॉल में एक और महत्वपूर्ण कदम पूर्व प्रवाह चैम्बर (4.1 कदम) के लिए उन्हें इंजेक्शन लगाने के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर 15-30 मिनट के लिए उन्हें incubating द्वारा आरटी पर रखा जाता है कि PMNs का भड़काना है. इससे उन्हें ऐसे अन्तःचूचुक पर ICAM-1 या Vcam-1 के रूप में आसंजन अणुओं का पालन करने की इजाजत दी, ल्युकोसैट integrins का भड़काना में यह परिणाम है.
इस प्रोटोकॉल neutrophils की स्थानांतरगमन अध्ययन करने के लिए ही सीमित नहीं है. ऐसे monocytes या लिम्फोसाइटों के रूप में इसके अलावा अन्य ल्युकोसैट प्रकार इस्तेमाल किया जा सकता है. ल्युकोसैट प्रकार के बीच भिन्न हो सकती है leukocytes भड़काना, यानी कि कदम 4.1, ध्यान दें. इसके अलावा, endothelial कोशिकाओं के अन्य प्रकार का इस्तेमाल किया जा सकता है. इस के लिए यह महत्वपूर्ण रहता हैऐसे TNF-α या आईएल 1β के रूप में उपयुक्त भड़काऊ उत्तेजनाओं के साथ endothelial कोशिकाओं को उत्तेजित करने के लिए. Neutrophils transmigrating में जवाब नहीं देते तो, एक एन formyl एल मेथियोनाइल एल leucyl एल फेनिलएलनिन (fMLP) पेप्टाइड 16 के साथ neutrophils संक्षिप्त (5 मिनट) के इलाज पर विचार कर सकते. इस अन्तःचूचुक का पालन करने के लिए उन्हें अधिक खतरा बना, आगे भी, विशेष रूप से उनके integrins में, neutrophils को प्रोत्साहित करेंगे.
आम तौर पर 1 DYN / 2 सेमी प्रवाह गति प्रयोग किया जाता है. इस प्रवाह की गति के बाद केशिका venules, सबसे ल्युकोसैट transendothelial माइग्रेशन 17 होती है जहां साइटों में मापा जाता है. वर्णित प्रवाह कक्षों का उपयोग करना, यह 10 DYN / 2 सेमी करने के प्रवाह की गति को बढ़ाने के लिए संभव है. हालांकि, यह आगे कतरनी बढ़ाने के लिए सिफारिश नहीं है. यह प्रवाह चैम्बर से कोशिकाओं के ट्यूबिंग और टुकड़ी के अवांछित रिसाव में परिणाम हो सकता है.
चित्रा 3 में वर्णित परिणाम ये दर्शाते हैं किएंटीबॉडी कल्पना और ल्युकोसैट diapedesis दौरान endothelial सेल सेल जंक्शनों की गतिशीलता का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. विशेष रूप से, मौजूदा स्थानांतरगमन assays के अलावा इस प्रोटोकॉल वास्तविक समय में शारीरिक प्रवाह शर्तों के तहत transcellular प्रवास से paracellular भेदभाव करने की अनुमति देता है. एंटीबॉडी सेल सेल जंक्शनों दाग के बाद से, एक / PECAM -1 साइटों-cadherin VE nonpositive बनाम VE-cadherin / PECAM-1-सकारात्मक जंक्शनों पार कि leukocytes की संख्या स्कोर कर सकते हैं. इस तरह, transcellular प्रवास paracellular प्रवास से भेदभाव किया जा सकता है.
इस अध्ययन में इस्तेमाल PECAM-1 एंटीबॉडी दूसरा बाह्य डोमेन के खिलाफ निर्देशित है: यह इन एंटीबॉडी वे करने के लिए बाध्य प्रोटीन के समारोह के साथ हस्तक्षेप नहीं करते कि रेखांकित करने के लिए महत्वपूर्ण है. एंटीबॉडी कम से कम नहीं था सुझाव है कि प्रसार या एक monolayer के गठन में कोई दोष नहीं दिखा था एंटीबॉडी की उपस्थिति में चढ़ाया गया है कि endothelial कोशिकाओं,endothelial कोशिकाओं के बीच homotypic बातचीत के साथ हस्तक्षेप. इसके अलावा, दोनों एंटीबॉडी endothelial monolayer के माध्यम से विस्थापित करने के लिए neutrophils की क्षमता क्षीण नहीं है. साथ ही, अभाव या एंटीबॉडी की उपस्थिति में endothelial monolayer भर में बसना कि neutrophils की संख्या (नहीं दिखाया डेटा) बदला नहीं जाता है. महत्वपूर्ण बात है, लेजर confocal माइक्रोस्कोपी स्कैनिंग हमें एक साथ अलग फ्लोरोसेंट चैनलों और डीआईसी रिकॉर्ड करने के लिए संभावना देता है.
एक न्युट्रोफिल endothelial सेल सेल जंक्शन पार और leukocytes transcellular बनाम अन्य, यानी, paracellular पर एक मार्ग का चयन क्यों समझने में मदद मिलेगी जब इस प्रकार, इस परख एक ही समय में VE-cadherin और PECAM-1 की गतिशीलता के अध्ययन की अनुमति देता है.
The authors have nothing to disclose.
The authors thank Dr. P.L. Hordijk for critically reading the manuscript. AED is supported by a Landsteiner Foundation for Blood Transfusion Research (LSBR) fellowship (grant #1028). JK is supported by the Dutch Heart Foundation (2005T3901). JDvB is a NHS Dekker fellow (grant #2005T039).
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description | |
μ-Slide VI | IBIDI | 80606 | Flow-chamber | |
0.45 μm filter | Whatman/GE Lifesciences | 10462100 | ||
1 mL syringe | BD Plastipak | 300013 | ||
20 mL syringe | BD Discardit II | 366296 | ||
21G needle | BD Microlance | 301155 | ||
Albumin | Sanquin | 15522644 | ||
Ammunium chloride (NH4Cl) | Merck | 1009245000 | ||
Calcium chloride (CaCl2) | Sigma-Aldrich | 449709 | ||
EBM-2 Basal medium + EGM-2 SingleQuot Kit Suppl. & Growth Factors | Lonza | CC-3156 + CC-4176 | media | |
EDTA (Titriplex III) | Merck | 1370041000 | ||
Falcon tubes | Corning Life Sciences | 352096 | ||
Fibronectin | Sigma-Aldrich | F1141-2MG | FN | |
Glucose | Sigma-Aldrich | G7528 | ||
HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | ||
In-line Luer Injection port | IBIDI | 10820 | ||
Magnesium sulfate heptahydrate (MgSO4.7H2O) | Merck | 105886 | ||
PECAM-1-ALEXA-647 | BD Pharmingen | 561654 | clone WM59 stock concentration 0.1mg/mL |
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Percoll | GE Healthcare Life Sciences | 17-0891-09 | ||
Phosphate Buffered Saline | Fresenius Kabi Nederland | M090001/01NL | PBS | |
Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P9541 | ||
Potassium hydrogen carbonate (KHCO3) | Merck | 1048540500 | ||
Potassium phosphate dibasic trihydrate (K2HPO4) | Sigma-Aldrich | P5504 | ||
Silicone Tygon 3350 tubing | VWR | 228-4331 | tubing | |
Sodium chloride (NaCl) | Calbiochem (Millipore) | 567441 | ||
Syringe pump | Harvard Apparatus | model number 55-5920 | ||
TNFα | Peprotech | 300-01A | tumor necrosis factor | |
trisodium citrate | Merck | 1.06447.5000 | TNC | |
Vacuettes | Greiner, Germany | 980044 | ||
VE-Cadherin-FITC | BD Pharmingen | 560411 | clone 55-7H1 | stock concentration 0.5mg/mL |
Zeiss LSM510 META | Carl Zeiss MicroImaging, Jena, Germany | |||
Zen Software 2008 | Carl Zeiss MicroImaging, Jena, Germany |