백혈구는 세포층 또는 세포 횡단 경로를 사용하여 내피 세포 단일 층을 교차. 우리는 내생 접합부의 분포가 VE-cadherin의 및 PECAM-1 백혈구 transendothelial 이주 중에 생리 흐름에 따라이 윤회 노선을 구별하기 위해 수행하는 간단한 분석을 개발했다.
염증 동안 백혈구는 혈액 순환을 떠나 기본 조직에서 병원균 침입 싸울 내피 교차합니다. 이 과정은 백혈구 transendothelial 이주로 알려져있다. 내피 단일 층을 통과하는 백혈구에 대한 두 가지 방법으로 설명되었다 : 즉, 세포 – 세포 접합 및 세포 횡단 노선을 통해 세포층의 경로, 즉, 내피 세포의 몸을 통해. 그러나 파라 및 세포 횡단 경로를 구별하는 것은 기술적으로 곤란 하였다. 우리는 내생의 분포가 VE-cadherin의 및 PECAM-1을 생리 흐름 조건에서 호중구 transendothelial 마이그레이션하는 동안 공부를 할 수있는 간단한 체외 분석을 개발했다. 호중구 관류 이전에, 내피 세포 간단히 VE-cadherin의 및 PECAM-1에 대한 형광 표지 항체를 처리 하였다. 전기 세포 substra 의해 결정되었을 때 이러한 항체는, 두 단백질의 기능을 방해하지 않았다테 임피던스 감지 및 FRAP 측정. 이 분석을 사용하여, 우리는 내생의 분포가 흐름 조건에서 transendothelial 마이그레이션하는 동안 및 PECAM-1-cadherin의를 VE 및 내피 세포에서 백혈구의 파라와 세포 횡단 마이그레이션 경로를 구별 수행 할 수 있었다.
효율적이고 엄격하게 제어 백혈구 transendothelial 마이그레이션 (TEM)은 이러한 면역 감시 및 급성 염증 생리 학적 과정의 핵심 중요하다. 그러나, 특정 병태 생리 조건 하에서, 제어되지 않는 과도 TEM 및 만성 염증성 질환 (예, 류마티스 관절염, 아테롬성 동맥 경화증, 천식)에서 얻어진 관찰된다. 종양 세포는 1-3 전이하는 순환을 떠나는 또한 종양 세포 전이 동안 transendothelial 마이그레이션 프로세스 수단이다. 구체적으로는 과도한 백혈구 또는 종양 세포 TEM을 방해하기 위해,이 프로세스의 상세한 규정의 이해가 필요하다.
그것은 TEM 프로세스가 여러 단계를 통해 발생하는 것으로 생각된다. 정육점 및 스프링에 의해이 수십 년 전에 검토 정액 연구는, TEM 4,5의 과정을 설명하는 다단계 모델로했다. 이 모델은 여전히 광고하지만, 사실이 보유하고ditional 단계 6를 포함하고있다. 알론은 외. 내피 (7)의 표면에 고정화 케모카인의 존재에 대한 필요성을 설명했다. 최근에, 그들은 내피 세포 자체가 내피 선 단면 팔에서 발표하는 케모카인을 생성 것을 보여 주었다. 또한, 동일 그룹 TEM 7 중에 유동 조건의 중요성을 제안했다. 최근, 두 개의 서로 다른 노선의 백혈구에 초점을 맞춘 여러 서적은 TEM의 최종 diapedesis 단계에서 걸릴 수 있습니다. 그들은, 즉, 세포 – 세포 접합을 통해 세포층의 마이그레이션 경로를 이동하거나, 세포 횡단 마이그레이션 경로를 9로 알려진 내피 세포의 몸을 통해 통과 할 수 있습니다. 전차 승무원 및 동료에서는 이러한 경로를 공부하고 제대 정맥 내피 단일 층 (10)을 횡단 할 때 백혈구가 우선적으로 세포 횡단 노선 (10 %)를 통해 세포층의 마이그레이션 경로 (90 %)을 선택할 것을 결론을 내렸다.그러나, 다른 기원에서 내피 세포가 사용 된 때, 예를 들면, 뇌 미세 혈관보다 백혈구 세포 횡단 경로 (30 %) (11)을 사용했다. 이 VE-cadherin의 알파 – 카테닌에 대한 키메라 Vestweber 그룹은 최근 세포 – 세포 접합이 내생를 대체 노크 동물 모델을 사용하여 서로 해리 수 없습니다 때 VE-cadherin의를 보여 백혈구 TEM 완전히 12을 차단되었습니다 . 놀랍게도, 저자는 TEM 여러 차단, 전부는 아니지만, 조직 된 것으로 나타났습니다. 전반적으로,이 우아한 실험은이 결정을 트리거 규제 신호는 아직 알 수 있지만 백혈구, 세포 횡단 노선을 통해 세포층의 경로를 선호하는 것으로 나타났다.
백혈구의 대부분이 세포층 이동 경로를 선호한다하더라도, 그것은 두 경로를 구별하는 것은 여전히 어렵다. 내피 세포 – 세포 junct의 역할에 초점을 맞추고 몇몇 연구에도 불구하고 그 외에있어서이온은 이러한 접합의 역학, 특히 접합부 단백질은 VE-cadherin의 및 PECAM-1, 백혈구 횡단 논쟁에서 여전히 동안. 우리는 이러한 접합 분자가 형광 표지 된 항체를 사용하여 유동 생리적 조건 하에서 백혈구 diapedesis 중에 실시간으로 모니터링 할 수있는 비교적 간단한 분석을 개발 하였다. 이러한 항체는 방해 또는 표적 단백질의 접합부 무결성이나 이동성을 차단하지 않았다. 이 분석은 우리가 세포층 TEM 과정에서 접합부 단백질의 역학을 수행 할 수 있습니다. 또한,이 분석은 또한 파라 및 세포 횡단 이동 경로 간의 판별한다.
이것은 세포 자멸사 및 파쇄 단층의 원인이되므로이 프로토콜의 경우, 이는, 유동 챔버의 기포 형성을 방지하는 것이 중요하다. 이를 방지하기 위해, 우리는 튜브가 흐름 챔버에 연결되어있는 단계 4.2 및 4.5에 특별한 관심을 지불 강조하고 싶습니다. 프로토콜의 또 다른 중요한 단계는 이전의 흐름 챔버 (단계 4.1)에 주입에 37 ° C에서 15 ~ 30 분을 배양하여 실온에서 보관하는 백혈구의 프라이밍이다. 이것은 그들이 같은 내피 세포에서 ICAM-1 또는 VCAM-1과 같은 부착 분자에 부착 할 수 있도록, 백혈구 인테그린 프라이밍의 결과.
이 프로토콜은 호중구의 윤회를 연구하기 위해 제한되지 않습니다. 이러한 단핵구 또는 림프구와 같은 또 다른 유형의 백혈구가 사용될 수있다. 백혈구의 종류에 따라 상이 할 수 백혈구를 프라이밍, 즉 해당 단계 4.1을합니다. 또한, 내피 세포의 다른 유형을 사용할 수있다. 이를 위해이 여전히 중요같은 TNF-α와 IL-1β 적절한 염증 자극으로 내피 세포를 자극한다. 호중구 transmigrating 응답하지 않으면, 하나의 N-포르 밀-L-메티 오닐-L-로이 실-L-페닐알라닌 (FMLP) 펩티드 16 호중구 간단히 (5 분) 처리 고려할 수있다. 이 내피 세포에 부착하기가 더 많은 경향이있어 더욱 특히 자신의 인테그린에, 호중구를 자극 할 것이다.
일반적으로 1 DYN / ㎝ 2 흐름 속도가 사용됩니다. 이 흐름 속도는 후 모세관 정맥, 대부분의 백혈구 transendothelial 마이그레이션 (17)를 발생 사이트로 측정됩니다. 설명한 플로우 챔버를 사용하면, 10 DYN / cm 2 유동 속도까지 증가시킬 수있다. 그러나, 더 전단을 증가하지 않는 것이 좋습니다. 이 흐름 챔버에서 세포의 튜브와 분리의 원치 않는 노출시키는 결과를 가져올 수 있습니다.
도 3에 설명 된 결과는 이러한 것을 나타항체는 시각화하고 백혈구 diapedesis 동안 내피 세포 – 세포 접합의 역학을 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 특히, 기존 윤회 분석법 이외에이 프로토콜은 실시간 흐름 생리적 조건 하에서 세포 횡단 이동부터 세포층을 구별 할 수있다. 항체는 세포 – 세포 접합을 얼룩 때문에, 하나는 / PECAM – 한 사이트-cadherin의를 VE 정이 대 VE-cadherin의 / PECAM-1 양성 접합을 교차 백혈구의 수를 점수 수 있습니다. 이 방법으로, 세포 횡단 마이그레이션은 세포층의 마이그레이션 구별 할 수 있습니다.
본 연구에서 사용 PECAM-1 항체가 상기 제 외 도메인에 대하여 지시한다 : 이들 항체들은 바인딩 단백질의 기능을 방해하지 않는 것을 강조하는 것이 중요하다. 항체는 적어도하지 않았다는 것을 시사 확산 또는 단일 층을 형성하는 결함을 나타내지 않았다 항체의 존재하에 도금 된 내피 세포,내피 세포 사이의 동형 상호 작용을 방해합니다. 그 외에도, 두 항체가 내피 단층으로 마이그레이션하는 호중구의 능력을 손상하지 않는다. 또한, 부재 또는 항체의 존재하에 내피 단층 걸쳐 transmigrate 호중구의 수 (데이터는 도시하지 않음)를 변경하지 않는다. 중요한 것은, 공 초점 레이저 주사 현미경은 우리에게 동시에 서로 다른 형광 채널 및 DIC를 기록 할 수있는 가능성을 준다.
호중구는 내피 세포 – 세포 접합을 교차하고 백혈구 세포 횡단 대 다른, 즉, 세포층을 통해 하나의 경로를 선택하는 이유를 이해하는 데 도움이 될 것입니다 경우에 따라서,이 분석은 동시에 VE-cadherin의 및 PECAM-1의 역학을 공부하고 있습니다.
The authors have nothing to disclose.
The authors thank Dr. P.L. Hordijk for critically reading the manuscript. AED is supported by a Landsteiner Foundation for Blood Transfusion Research (LSBR) fellowship (grant #1028). JK is supported by the Dutch Heart Foundation (2005T3901). JDvB is a NHS Dekker fellow (grant #2005T039).
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description | |
μ-Slide VI | IBIDI | 80606 | Flow-chamber | |
0.45 μm filter | Whatman/GE Lifesciences | 10462100 | ||
1 mL syringe | BD Plastipak | 300013 | ||
20 mL syringe | BD Discardit II | 366296 | ||
21G needle | BD Microlance | 301155 | ||
Albumin | Sanquin | 15522644 | ||
Ammunium chloride (NH4Cl) | Merck | 1009245000 | ||
Calcium chloride (CaCl2) | Sigma-Aldrich | 449709 | ||
EBM-2 Basal medium + EGM-2 SingleQuot Kit Suppl. & Growth Factors | Lonza | CC-3156 + CC-4176 | media | |
EDTA (Titriplex III) | Merck | 1370041000 | ||
Falcon tubes | Corning Life Sciences | 352096 | ||
Fibronectin | Sigma-Aldrich | F1141-2MG | FN | |
Glucose | Sigma-Aldrich | G7528 | ||
HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | ||
In-line Luer Injection port | IBIDI | 10820 | ||
Magnesium sulfate heptahydrate (MgSO4.7H2O) | Merck | 105886 | ||
PECAM-1-ALEXA-647 | BD Pharmingen | 561654 | clone WM59 stock concentration 0.1mg/mL |
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Percoll | GE Healthcare Life Sciences | 17-0891-09 | ||
Phosphate Buffered Saline | Fresenius Kabi Nederland | M090001/01NL | PBS | |
Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P9541 | ||
Potassium hydrogen carbonate (KHCO3) | Merck | 1048540500 | ||
Potassium phosphate dibasic trihydrate (K2HPO4) | Sigma-Aldrich | P5504 | ||
Silicone Tygon 3350 tubing | VWR | 228-4331 | tubing | |
Sodium chloride (NaCl) | Calbiochem (Millipore) | 567441 | ||
Syringe pump | Harvard Apparatus | model number 55-5920 | ||
TNFα | Peprotech | 300-01A | tumor necrosis factor | |
trisodium citrate | Merck | 1.06447.5000 | TNC | |
Vacuettes | Greiner, Germany | 980044 | ||
VE-Cadherin-FITC | BD Pharmingen | 560411 | clone 55-7H1 | stock concentration 0.5mg/mL |
Zeiss LSM510 META | Carl Zeiss MicroImaging, Jena, Germany | |||
Zen Software 2008 | Carl Zeiss MicroImaging, Jena, Germany |