एकल अणु प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा रिसेप्टर गतिशीलता के उच्च संकल्प Spatiotemporal विश्लेषण
Summary
This protocol describes how to use total internal reflection fluorescence microscopy to visualize and track single receptors on the surface of living cells and thereby analyze receptor lateral mobility, size of receptor complexes as well as to visualize transient receptor-receptor interactions. This protocol can be extended to other membrane proteins.
Abstract
एकल अणु माइक्रोस्कोपी उन पहलू (जैसे., कैनेटीक्स, विभिन्न राज्यों और आबादी, क्षणिक बातचीत के सह – अस्तित्व) आम तौर पर कलाकारों की टुकड़ी माप में छिपे हुए हैं, जो इस तरह के रूप के विषय में विशेष रूप से, संकेतन अणुओं के व्यवहार का विश्लेषण करने के लिए एक शक्तिशाली दृष्टिकोण के रूप में उभर रहा है मानक जैव रासायनिक या माइक्रोस्कोपी तरीकों के साथ प्राप्त की. इस प्रकार, इस तरह रिसेप्टर रिसेप्टर बातचीत के रूप में गतिशील घटनाओं, उच्च spatiotemporal संकल्प के साथ एक जीवित कोशिका में वास्तविक समय में पीछा किया जा सकता. इस प्रोटोकॉल छोटे और चमकदार जैविक fluorophores और सीधे जीवित कोशिकाओं की सतह पर एक रिसेप्टर्स कल्पना करने के लिए कुल आंतरिक प्रतिबिंब प्रतिदीप्ति (TIRF) माइक्रोस्कोपी के साथ लेबलिंग पर आधारित एक विधि का वर्णन करता है. यह दृष्टिकोण एक ठीक, रिसेप्टर्स के स्थानीयकरण रिसेप्टर परिसरों के आकार को मापने, और इस तरह क्षणिक रिसेप्टर रिसेप्टर बातचीत के रूप में गतिशील घटनाओं पर कब्जा करने की अनुमति देता है. प्रोटोकॉल पे करने के लिए एक विस्तृत विवरण प्रदान करता हैनमूना तैयार करने, छवि अधिग्रहण और छवि विश्लेषण सहित एक एकल अणु प्रयोग, rform. एक उदाहरण के रूप में, इस विधि के आवेदन दो जी प्रोटीन युग्मित रिसेप्टर्स का विश्लेषण करने के लिए, यानी., 2 एड्रीनर्जिक और γ-aminobutyric एसिड ग्रुप बी (GABA बी) रिसेप्टर β, बताया जाता है. प्रोटोकॉल अन्य झिल्ली प्रोटीन और अलग सेल मॉडल, अभिकर्मक तरीकों और रणनीतियों लेबलिंग के लिए अनुकूलित किया जा सकता है.
Introduction
कोशिका की सतह पर स्थित रिसेप्टर्स बाह्य वातावरण भावना और इस तरह odorants, आयनों, छोटे न्यूरोट्रांसमीटर और बड़े प्रोटीन हार्मोन के रूप में उत्तेजनाओं की एक किस्म का जवाब. सेलुलर झिल्ली के तरल पदार्थ प्रकृति रिसेप्टर्स और अन्य झिल्ली प्रोटीन के आंदोलनों की अनुमति देता है. यह प्रोटीन परिसरों और ऐसे कार्यात्मक इकाइयों को इकट्ठा करने में और सेल इंटीरियर में संकेत transduce को रिसेप्टर्स द्वारा इस्तेमाल उन लोगों के रूप में क्षणिक प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत की घटना के गठन के लिए आवश्यक है. उदाहरण के लिए, सेल सतह रिसेप्टर्स 1 के सबसे बड़े परिवार का गठन जो जी प्रोटीन युग्मित रिसेप्टर्स (GPCRs),, संकेत पारगमन के ठीक tuned विनियमन में शामिल होना प्रतीत होता है और जो di-/oligomers, फार्म करने के लिए सुझाव दिया गया है महत्वपूर्ण शारीरिक और औषधीय परिणाम 2-5 हो सकता है.
एकल अणु माइक्रोस्कोपी सीधे उच्च spatiotemp साथ दृश्यमान करने की काफी संभावना हैमौखिक संकल्प उनकी एसोसिएशन सहित जीवित कोशिकाओं की सतह पर स्थित व्यक्ति रिसेप्टर्स की गतिशील व्यवहार dimers और उच्च आदेश आणविक परिसरों 6-10 बनाने के लिए. यह आमतौर पर अणुओं के हजारों या लाखों लोगों की औसत व्यवहार की रिपोर्ट जो मानक जैव रासायनिक और माइक्रोस्कोपी तरीकों की तुलना में कई लाभ प्रदान करता है.
एक पर्याप्त उज्ज्वल और photostable फ्लोरोफोरे के साथ प्रोटीन लेबलिंग एकल अणु माइक्रोस्कोपी के लिए आवश्यक है. इस प्रोटोकॉल covalently सेल सतह रिसेप्टर्स करने के लिए छोटे और चमकदार जैविक fluorophores संलग्न करने के लिए हाल ही में शुरू की तस्वीर टैग 11 का लाभ लेता है. तस्वीर अचल fluorophore संयुग्मित benzylguanine (फ्लोरोफोरे-बीजी) डेरिवेटिव के साथ लेबल किया जा सकता है जो मानव डीएनए की मरम्मत एंजाइम हे 6 alkylguanine डीएनए alkyltransferase से ली गई एक 20 केडी प्रोटीन टैग है. क्लिप, तस्वीर से ली गई एक और इंजीनियर टैग, बजाय फ्लोरोफोरे सी के साथ लेबल किया जा सकताonjugated benzylcytosine डेरिवेटिव 12.
इस पांडुलिपि में सूचना दी प्रोटोकॉल transfect और लेबल छोटे जैविक fluorophores के साथ 11 रिसेप्टर्स तस्वीर में चिह्नित और जीवित कोशिकाओं 10 की सतह पर एक रिसेप्टर्स या रिसेप्टर परिसरों कल्पना करने के लिए कुल आंतरिक प्रतिबिंब प्रतिदीप्ति (TIRF) माइक्रोस्कोपी का उपयोग कैसे करें. एक extracellularly तस्वीर में चिह्नित सेल सतह प्रोटीन 10 के> 90% लेबलिंग दक्षता में सूचना दी प्रोटोकॉल का परिणाम है. रिसेप्टर परिसरों का आकार और गतिशीलता का विश्लेषण करने के लिए, साथ ही क्षणिक रिसेप्टर रिसेप्टर बातचीत कब्जा करने के लिए एकल अणु डेटा का उपयोग करने के बारे में अधिक जानकारी प्रदान की जाती है. पूरे प्रोटोकॉल का एक योजनाबद्ध कार्यप्रवाह चित्रा 1 में दी गई है. एक उदाहरण के रूप में, चीनी हैम्स्टर अंडाशय तस्वीर में चिह्नित जी प्रोटीन युग्मित रिसेप्टर्स (GPCRs) के साथ (चो) कोशिकाओं के अभिकर्मक के रूप में एक fluorophore-बीजी व्युत्पन्न के साथ लेबलिंग द्वारा पीछा अच्छी तरह से अपने आवेदन quantif के रूप मेंY और मॉनिटर रिसेप्टर di-/oligomerization वर्णित हैं. इस प्रोटोकॉल अन्य सेल सतह प्रोटीन और फ्लोरोसेंट टैग (जैसे., क्लिप), और साथ ही अन्य अभिकर्मक और लेबलिंग तरीकों के लिए बढ़ाया जा सकता है.
Protocol
Representative Results
Discussion
वर्णित प्रोटोकॉल एकल अणु के स्तर पर स्थानिक व्यवस्था, गतिशीलता और सेल सतह रिसेप्टर परिसरों के आकार का विश्लेषण की अनुमति देता है. फ्लोरोसेंट प्रोटीन के उपयोग की तुलना में, उज्जवल और अधिक photostable हैं जो छो?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The development of this protocol was supported by grants from the European Research Council (Advanced Grant TOPAS to M.J.L.) and the Deutsche Forschungsgemeinschaft (Grants CA 1014/1-1 to D.C. and SFB487 to M.J.L.). T.S. was supported by the Alexander von Humboldt Foundation.
Materials
| Chloroform | AppliChem GmbH | A1585 | CAUTION: toxic and irritating substance as well as a possible carcinogen |
| NaOH | Sigma-Aldrich | S8045 | CAUTION: strong base and highly corrosive reagent |
| Absolute ethanol | Sigma-Aldrich | 32205 | |
| Glass coverslip | Marienfeld-Superior | 111640 | 24 mm diameter, 0.13-0.16 mm thickness |
| 0.2 mm sterile filter | Sarstedt | 83.1826.001 | |
| CHO cells | ATCC, USA | ATCC CCL-61 | Chinese hamster ovary cell line |
| 6-well cell culture plare | Nunc | 140675 | |
| DMEM/F-12 medium | GIBCO, Life Technologies | 11039-021 | Phenol-red free medium |
| Fetal bovine serum | Biochrom | S 0115 | |
| Penicillin – streptomycin | Pan Biotech GmbH | P06-07 100 | |
| Trypsin-EDTA | Pan Biotech GmbH | P10-23100 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen, Life Technologies | 11668-019 | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Invitrogen, Life Technologies | 31985-047 | |
| Fluorophore-conjugated benzylguanine | New England BioLabs | S9136S | SNAP-Surface Alexa Fluor 647. Make a 1 mM stock solution in DMSO. Store at -20°C. |
| DMSO | AppliChem GmbH | A1584 | |
| Imaging buffer: | 137 mM NaCl, 5.4 mM KCl, 2 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 10 mM HEPES, pH 7.3, sterile-filtered | ||
| NaCl | AppliChem GmbH | A1371 | |
| KCl | AppliChem GmbH | A3582 | |
| CaCl2 | AppliChem GmbH | A2303 | |
| MgCl2 | AppliChem GmbH | A3618 | |
| HEPES | AppliChem GmbH | A3724 | |
| Imaging chamber | Molecular Probes, Life Technologies | A-7816 | Attofluor Cell Chamber, for microscopy |
| TIRF-M | Leica | Model: DMI6000B | |
| TIRF objective | Leica | 11 506 249 | HCX PL Apo 100x/1.46 Oil CORR |
| EM-CCD camera | Roper Scientific | Photometrics Cascade 512B | |
| Temperature controller | Pecon | Tempcontrol 37-2 digital | |
| ImageJ software | NIH, USA | http://rsbweb.nih.gov/ij | |
| u-track software | Laboratory for computational cell biology, Dept. of Cell Biology, Harvard Medical School, USA | http://lccb.hms.harvard.edu/software.html | |
| Matlab software | The MathWorks, USA |
References
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