Högupplöst Spatiotemporal Analys av Receptor Dynamics av Single-molekyl fluorescensmikroskopi
Summary
This protocol describes how to use total internal reflection fluorescence microscopy to visualize and track single receptors on the surface of living cells and thereby analyze receptor lateral mobility, size of receptor complexes as well as to visualize transient receptor-receptor interactions. This protocol can be extended to other membrane proteins.
Abstract
Enda molekyl mikroskopi framstår som en kraftfull metod för att analysera beteendet hos signalmolekyler, särskilt när det gäller sådana aspekter (t ex., Kinetik, samexistens mellan olika stater och befolkningar, transienta interaktioner), som normalt är dolda i ensemblemätningar, till exempel de som erhålls med standard biokemiska eller mikroskopiska metoder. Således, dynamiska händelser, såsom receptor-receptorinteraktioner, kan följas i realtid på en levande cell med hög Spatiotemporal upplösning. Detta protokoll beskriver en metod som bygger på märkning med små och ljusa organiska fluoroforer och total inre reflektion fluorescens (TIRF) mikroskopi för att direkt visualisera enstaka receptorer på ytan av levande celler. Detta tillvägagångssätt gör att man kan exakt lokalisera receptorer, mäta storleken på receptorkomplex, och fånga dynamiska händelser såsom övergående receptor-receptorinteraktioner. Protokollet ger en detaljerad beskrivning av hur man perform en enda molekyl experiment, inklusive provberedning, bildtagning och bildanalys. Som ett exempel på tillämpningen av denna metod analysera två G-proteinkopplade receptorer, dvs., Β 2-adrenerga och γ-aminosmörsyra typ B (GABA B)-receptorn, har rapporterats. Protokollet kan anpassas till andra membranproteiner och olika cellmodeller, transfektionsmetoder och märkningsstrategier.
Introduction
Receptorer belägna på cellytan avkänna den extracellulära miljön och svara på en mängd olika stimuli, såsom doftämnen, joner, små signalsubstanser och stora proteinhormoner. Den flytande karaktär av cellmembran tillåter rörelser receptorer och andra membranproteiner. Detta är viktigt för bildningen av proteinkomplex och förekomsten av transienta protein-proteininteraktioner, såsom de som används av receptorer för att montera in i funktionella enheter och omvandla signaler till cellens inre. Till exempel, G-proteinkopplade receptorer (GPCRs), som utgör den största familjen av receptorer på cellytan 1, har föreslagit att bilda di-/oligomers, som verkar vara inblandade i finjusteras regleringen av signalöverföring och kan ha viktiga fysiologiska och farmakologiska konsekvenser 2-5.
Enda molekyl mikroskopi har stor potential för direkt visualisering med hög spatiotemporal upplösning det dynamiska beteendet hos enskilda receptorer på ytan av levande celler, inklusive deras förening för att bilda dimerer och högre ordningens molekylkomplex 6-10. Detta har flera fördelar jämfört med vanliga biokemiska och mikroskopimetoder, som vanligtvis rapporterar den genomsnittliga beteendet hos tusentals eller miljontals molekyler.
Protein märkning med tillräckligt ljus och fotostabil fluorofor är viktigt för enda molekyl mikroskopi. Detta protokoll tar fördel av det nyligen introducerade SNAP-tagg 11 för att kovalent fästa små och ljusa organiska fluoroforer till cellytereceptorer. SNAP är ett 20 kD-protein tag härledd från det humana DNA-reparationsenzym O 6-alkylguanin-DNA-alkyltransferas, som kan irreversibelt märkt med fluorofor-konjugerad bensylguanin (fluorofor-BG)-derivat. CLIP, en ytterligare engineered taggen härledd från SNAP, kan i stället märkt med fluorofor-conjugated benzylcytosine derivat 12.
Det protokoll som rapporteras i detta manuskript förklarar hur att transfektera och etikett SNAP-tagged 11 receptorer med små organiska fluoroforer och använder total intern reflektion fluorescens (TIRF) mikroskopi för att visualisera enstaka receptorer eller receptorkomplex på ytan av levande celler 10. De rapporterade protokoll resultat i> 90% märkningseffektivitet av ett extracellulärt SNAP-tagged cellytprotein 10. Ytterligare information om hur du använder enda molekyl data för att analysera storleken och rörlighet för receptorkomplex, samt att fånga upp övergående receptor-receptorinteraktioner, lämnas. Ett schematiskt arbetsflödet för hela protokollet ges i figur 1. Som ett exempel transfektion av ovarialceller från kinesisk hamster (CHO)-celler med SNAP-etikette G-proteinkopplade receptorer (GPCR), följt av märkning med en fluorofor-BG-derivat som samt dess tillämpning på quantify och monitor receptor di-/oligomerization beskrivs. Detta protokoll kan utvidgas till andra cellytan proteiner och fluorescerande taggar (t.ex.., CLIP), liksom till andra transfektion och märkningsmetoder.
Protocol
Representative Results
Discussion
Det beskrivna protokollet kan analys av det rumsliga arrangemanget, rörlighet och storleken av cellytreceptor komplexen vid enda molekyl nivå. Jämfört med användning av fluorescerande proteiner, märkning med små organiska fluoroforer, som är ljusare och mer fotostabila, har fördelen att tillåta utvidgad visualisering av enstaka receptorpartiklar. Eftersom extremt låga nivåer uppnås (<0.45 receptor partiklar / ìm 2), egenskaper receptorer och andra membranproteiner kan analyseras vid densitete…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The development of this protocol was supported by grants from the European Research Council (Advanced Grant TOPAS to M.J.L.) and the Deutsche Forschungsgemeinschaft (Grants CA 1014/1-1 to D.C. and SFB487 to M.J.L.). T.S. was supported by the Alexander von Humboldt Foundation.
Materials
| Chloroform | AppliChem GmbH | A1585 | CAUTION: toxic and irritating substance as well as a possible carcinogen |
| NaOH | Sigma-Aldrich | S8045 | CAUTION: strong base and highly corrosive reagent |
| Absolute ethanol | Sigma-Aldrich | 32205 | |
| Glass coverslip | Marienfeld-Superior | 111640 | 24 mm diameter, 0.13-0.16 mm thickness |
| 0.2 mm sterile filter | Sarstedt | 83.1826.001 | |
| CHO cells | ATCC, USA | ATCC CCL-61 | Chinese hamster ovary cell line |
| 6-well cell culture plare | Nunc | 140675 | |
| DMEM/F-12 medium | GIBCO, Life Technologies | 11039-021 | Phenol-red free medium |
| Fetal bovine serum | Biochrom | S 0115 | |
| Penicillin – streptomycin | Pan Biotech GmbH | P06-07 100 | |
| Trypsin-EDTA | Pan Biotech GmbH | P10-23100 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen, Life Technologies | 11668-019 | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Invitrogen, Life Technologies | 31985-047 | |
| Fluorophore-conjugated benzylguanine | New England BioLabs | S9136S | SNAP-Surface Alexa Fluor 647. Make a 1 mM stock solution in DMSO. Store at -20°C. |
| DMSO | AppliChem GmbH | A1584 | |
| Imaging buffer: | 137 mM NaCl, 5.4 mM KCl, 2 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 10 mM HEPES, pH 7.3, sterile-filtered | ||
| NaCl | AppliChem GmbH | A1371 | |
| KCl | AppliChem GmbH | A3582 | |
| CaCl2 | AppliChem GmbH | A2303 | |
| MgCl2 | AppliChem GmbH | A3618 | |
| HEPES | AppliChem GmbH | A3724 | |
| Imaging chamber | Molecular Probes, Life Technologies | A-7816 | Attofluor Cell Chamber, for microscopy |
| TIRF-M | Leica | Model: DMI6000B | |
| TIRF objective | Leica | 11 506 249 | HCX PL Apo 100x/1.46 Oil CORR |
| EM-CCD camera | Roper Scientific | Photometrics Cascade 512B | |
| Temperature controller | Pecon | Tempcontrol 37-2 digital | |
| ImageJ software | NIH, USA | http://rsbweb.nih.gov/ij | |
| u-track software | Laboratory for computational cell biology, Dept. of Cell Biology, Harvard Medical School, USA | http://lccb.hms.harvard.edu/software.html | |
| Matlab software | The MathWorks, USA |
References
- Pierce, K. L., Premont, R. T., Lefkowitz, R. J. Seven-transmembrane receptors. Nat Rev Mol Cell Biol. 3, 639-650 (2002).
- Angers, S., Salahpour, A., Bouvier, M. Dimerization: an emerging concept for G protein-coupled receptor ontogeny and function. Annu Rev Pharmacol Toxicol. 42, 409-435 (2002).
- Ferré, S., et al. Building a new conceptual framework for receptor heteromers. Nat Chem Biol. 5, 131-134 (2009).
- Milligan, G. G. protein-coupled receptor hetero-dimerization: contribution to pharmacology and function. Br J Pharmacol. 158, 5-14 (2009).
- Lohse, M. J. Dimerization in GPCR mobility and signaling. Curr Opin Pharmacol. 10, 53-58 (2010).
- Ulbrich, M. H., Isacoff, E. Y. Subunit counting in membrane-bound proteins. Nat Methods. 4, 319-321 (2007).
- Triller, A., Choquet, D. New concepts in synaptic biology derived from single-molecule imaging. Neuron. 59, 359-374 (2008).
- Hern, J. A., et al. Formation and dissociation of M1 muscarinic receptor dimers seen by total internal reflection fluorescence imaging of single molecules. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 2693-2698 (2010).
- Kasai, R. S., et al. Full characterization of GPCR monomer-dimer dynamic equilibrium by single molecule imaging. J Cell Biol. 192, 463-480 (2011).
- Calebiro, D., et al. Single-molecule analysis of fluorescently labeled G-protein-coupled receptors reveals complexes with distinct dynamics and organization. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 743-748 (2013).
- Keppler, A., et al. A general method for the covalent labeling of fusion proteins with small molecules in vivo. Nat Biotechnol. 21, 86-89 (2003).
- Gautier, A., et al. An engineered protein tag for multiprotein labeling in living cells. Chem Biol. 15, 128-136 (2008).
- Jaqaman, K., et al. Robust single-particle tracking in live-cell time-lapse sequences. Nat Methods. 5, 695-702 (2008).
- Saxton, M. J., Jacobson, K. Single-particle tracking: applications to membrane dynamics. Annu Rev Biophys Biomol Struct. 26, 373-399 (1997).
