Disseksjon og Immunostaining av Imaginal Discs fra<em> Drosophila melanogaster</em

Summary

The adult structures of Drosophila are derived from sac-like structures called imaginal discs. Analysis of these discs provides insight into many developmental processes including tissue determination, compartment boundary establishment, cell proliferation, cell fate specification, and planar cell polarity. This protocol is used to prepare imaginal discs for light/fluorescent microscopy.

Abstract

En vesentlig del av post-embryonal utvikling i bananflue, Drosophila melanogaster, foregår innenfor et sett av sac-lignende strukturer som kalles imaginal plater. Disse skivene gi opphav til en høy andel av voksne strukturer som finnes innenfor den voksne fly. Her beskriver vi en protokoll som har blitt optimalisert for å gjenopprette disse platene og forberede dem for analyse med antistoffer, transkripsjons journalister og protein feller. Denne prosedyren er best egnet for tynne vev som imaginal plater, men kan enkelt endres for bruk med tykkere vev som larve hjernen og voksen eggstokk. Den skriftlige protokoll og medfølgende videoen vil veilede leseren / seeren gjennom disseksjon av tredje stadium larver, fiksering av vev, og behandling av imaginal plater med antistoffer. Protokollen kan brukes til å dissekere Imaginal plater fra yngre første og andre stadiums larver i tillegg. Fordelen med denne protokollen er at den er forholdsvis kort, og den har blien optimalisert for den høye kvaliteten bevaring av den dissekerte vev. En annen fordel er at fikseringsfremgangsmåten som er anvendt fungerer godt med overveldende antall av antistoffer som gjenkjenner Drosophila-proteinene. Etter vår erfaring er det et svært lite antall sensitive antistoffer som ikke fungerer godt med denne prosedyren. I slike situasjoner, synes den rette til å være å bruke en alternativ fiksering cocktail mens du fortsetter å følge de retningslinjer som vi har fastsatt for disseksjon trinn og antistoff inkubasjoner.

Introduction

For mer enn et århundre bananflue, Drosophila melanogaster, har vært en ledende system for å studere utvikling, atferd og fysiologi. Utvikling i fly kan deles inn i to hovedstadier: embryonale og post-embryonale med mye av den sistnevnte finner sted innenfor epitel monolag kalt Imaginal plater ^1-3. Tegninger av imaginal plater ble først publisert i 1864 i august Weismann som en del av sin brede monografi om insekt utvikling ^en. Disse platene begynner sin utvikling under embryogenesen er mønstret i løpet av larvestadier, overleve den massive histolysis av de tidlige pupal stadier, og til slutt gi opphav til en høy andel av voksne strukturer som finnes innenfor den voksne fly ^1-14. Under larveutvikling hver plate gjør flere kritiske avgjørelser angående skjebne, form og størrelse. Innenfor de første og andre larve instars, er platene skal vedta en primær skjebne, etahengsle kupé grenser, vedta riktig form og generere den nødvendige antall celler ^15-16. I løpet av tredje larve instar og tidlig pre-pupal scenen, de imaginal plater fortsette å dele seg og blir mønstret som celler vedta sine terminal skjebner ^16.

Under den tidlige historien Drosophila utviklingsbiologi, ble imaginal plater studert nesten utelukkende i sammenheng med normal utvikling og i de begrensede tilfeller der et tap eller gevinst-of-funksjon mutant var levedyktig. Bruken av røntgenstråler for å indusere mitotisk rekombinasjon tillatt for dødelige mutasjoner for å bli analysert i cellekloner innenfor larve og voksne vev. Denne metoden har blitt forbedret ved innføringen av transgene metoder for å analysere tap og vinning-of-funksjon mutasjoner i både larver og voksne vev. Antallet antistoffer, transkripsjons reportere og protein feller for å beskrive den molekylære landskapet av villtype og mutant vev er også constantly økende. Ved hjelp av disse molekylære markører for å analysere tap og få-av-funksjon mutant cellekloner har gjort det stadig mulig å oppnå en sanntids forståelse av hvordan mutante celler avviker fra deres villtype fett under utvikling. Til riktig dra nytte av disse verktøyene og reagenser er det avgjørende å ha høy kvalitet preparater av imaginal plater som kan vises, fotografert og analysert. Målet med dette manuskriptet er å gi en optimalisert protokoll for isolering og utarbeidelse av øye-antennal plate kompleks (figur 1A). Den kan også med hell brukes for å isolere et bredt utvalg av flere plater, inkludert de som gir opphav til de vinger, halteres, T1-T3 ben og kjønnsorganene (figur 1B-E). Denne prosedyren, med mindre modifikasjoner, har blitt brukt til å isolere imaginal plater fra Drosophila i nesten åtti år.

Som beskrevet ovenfor, siden de fleste genene blir uttrykt under multiple utviklingsstadier og i en rekke vev, er det ofte umulig å studere effekter som null mutanter har på hele øyet som dyret dør i god tid før det tredje instar larvestadiet. Fire metoder har gjort studier av mer utviklede vev slik som retina betydelig mer medgjørlig. Den første er den Flippase (FLP) / Flippase Rekombinasjon Target (FRT) metode for generering av mutante cellekloner i en ellers vill type vev ^17-19. I dette tilfellet den mutante vev blir identifisert ved fravær av en visuell markør slik som grønt fluorescerende protein (GFP) og kan bli sammenlignet med det omliggende vev villtype hvori GFP er til stede (figur 2D). Den andre er den «FLP-out"-metoden, hvor en transgenet blir uttrykt i en populasjon av celler ^20. I dette tilfellet cellekloner er identifisert ved tilstedeværelsen av GFP og i forhold til det omkringliggende vill type vev som mangler GFP reporter (figur2E). Den tredje er Mosaic Analyse med et Repressible Cell Marker (MARCM) teknikken, som kombinerer elementer av FLP / FRT mutant klone og FLP-out ekspresjonssystemer ^21. Med denne metoden et transgen kan uttrykkes i en populasjon av celler som er samtidig en individuell mutant for genetisk locus. Som FLP-ut kloner, er MARCM kloner identifisert ved tilstedeværelsen av GFP og i forhold til det omkringliggende vill type vev som mangler GFP markør (figur 2F). Og til slutt, kan genene og RNAi konstruerer uttrykkes innen imaginal vev under kontroll av spesifikke promoter-Gal4 konstruksjoner. Disse fire metoder har økt interessen for å studere imaginal plater siden mutant eller over-uttrykk kloner eller mønstre kan sammenlignes direkte med tilstøtende villtype vev. Metoden som beskrives i denne prosedyren er utviklet slik at forskere som studerer den post-embryoutvikling av voksne vev i Drosophila,spesielt de som er avledet fra det øye-antennal plate, vil være i stand til å oppnå høy kvalitet vev for analyse. Selv om enkelte forskere har gjort små endringer, har kjernen i denne prosedyren (som vi beskriver her) holdt seg stort sett uendret. Siden oppnå høy kvalitet vev er kritisk til studiet av de imaginal plater Vi håper dette skriftlig protokoll og medfølgende videoen vil tjene som en verdifull undervisning ressurs.

Protocol

1. Utarbeidelse av Larver Fyll en 35 mm petriskål med disseksjon buffer. Plasser larver i petriskål og tillate dem å svømme rundt i noen minutter (selvrensende trinn). Overfør larver til en pool av disseksjon buffer på et silikonbasert disseksjon plate. Dette utvalget skal være i den ene kanten av tallerkenen. Den disseksjon plate består av en silikon-løsning som har blitt tømt og herdet i løpet av en glasspetriskål. Ved hjelp av en pasteur-pipette, plassere en størr…

Representative Results

Metoden som er beskrevet ovenfor pålitelig produserer høykvalitets materiale for analyse med in situ sonder, transkripsjons journalister, protein feller og antistoffer. I figur 1 viser vi øye-antenne, genital, vinge, haltere og leg-plater som er rutinemessig utvinnes med denne metoden. Disse platene har blitt behandlet med en phalloidin-konjugert fluorofor, som binder seg til F-aktin og derfor skisserer hver celle. Hvis vevet er blitt festet på riktig måte så den morfogenetiske fure i øy…

Discussion

Selv om denne fremgangsmåten har i stor grad fokusert på isolering og påfølgende behandling av øye-antennal plater, det er mottagelig for å bli brukt for å isolere og analysere vingen, haltere, ben og genital-plater (figur 4). Den eneste nødvendige modifikasjon av protokollen for å isolere disse platene (i motsetning til øyet-antennal plate) er metoden for grov disseksjon (§ 2 i protokollen). Det første ben torakale (T1) paret er funnet på den fremre av larven og kan utvinnes ved å følge …

Materials

Name of Material/Equipment	Company	Catalog Number	Comments
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit	Dow Corning	184 SIL ELAST KIT 0.5KG	Used to create base for dissection plate
Pryex Glass Petri Dish 150x20mm	Dow Corning	3160-152CO	Use the cover for dissection plate
#5 Dissecting Forceps	Ted Pella	525	Forceps must be kept very sharp
9 well watch glass	Vairous Vendors	N/A	Used for fixation of imaginal disc complexes
50ml Erlenmeyer Flask	Various Vendors	N/A
Small Stir Bar	Various Vendors	N/A	Small enough to fit into Erlenmeyer Flask
50ml Conical Tubes	Various Vendors	N/A
1.5ml Microfuge Tubes	Various Vendors	N/A	Clear or Dark depending upon application
Microfuge Rack	Various Vendors	N/A
Benchtop Rotator	Various Vendors	N/A	100ul volume should not splatter at low setting
Paraformaldehyde	Macron Chemicals	2-26555-1	Serves as fixative
Sodium Phosphate Monobasic	Sigma Chemical Co	S-3139	Used to make dissection and wash buffers
Sodium Phosphate Dibasic	Sigma Chemical Co	71636	Used to make dissection and wash buffers
Lysine	Acros Organics	125221000	Used in the fixative solution
Sodium Periodate	Sigma Chemical Co	S-1878	Used in the fixative solution
Triton X-100	EMD Chemicals	MTX1568-1	Used to perforate imaginal discs
Sodium Hydroxide	EM Science	SX0593-3	Used to dissolve paraformaldehyde
100% Normal Goat Serum`	Jackson Laboratories	005-000-121	Serves as a blocking solution
Primary Antibodies	Various Vendors	N/A	Dilute in 10% goat serum as directed by manufacturer
Seondary Antibodies	Various Vendors	N/A	Dilute in 10% goat serum as directed by manufacturer
Vectashield	Molecular Probes	H-1000	Prevents bleaching of samples
Microscope Slides	Fischer Scientific	48312-003
Glass Cover Slips 18x18mm	Fischer Scientific	12-542A
Kimwipe Tissue	Various Vendors	NA	Prevents Glass slides from adhering to silicone base
Panit Brush 000	Various Vendors	NA	Use to gently lower coverslip on to samples