Вскрытие и Иммуноокрашивание имагинальные диски из<em> Дрозофилы</em
Summary
The adult structures of Drosophila are derived from sac-like structures called imaginal discs. Analysis of these discs provides insight into many developmental processes including tissue determination, compartment boundary establishment, cell proliferation, cell fate specification, and planar cell polarity. This protocol is used to prepare imaginal discs for light/fluorescent microscopy.
Abstract
Значительная часть пост-эмбрионального развития дрозофилы, дрозофилы, происходит в рамках набора SAC-как структуры, называемые имагинальные диски. Эти диски порождают высокий процент взрослых структур, которые находятся в пределах взрослого лету. Здесь мы опишем протокол, который был оптимизирован для восстановления этих дисков и подготовить их для анализа с антителами, транскрипционных репортеров и белковых ловушек. Эта процедура лучше всего подходит для тонких тканей, таких как имагинальных дисках, но может быть легко модифицирована для использования с более толстыми тканей, таких как личиночной мозга и взрослых яичника. Письменное протокол и сопровождающие видео поможет читателя / зрителя через рассечения третьей возрастной стадии личинок, фиксации ткани и лечения имагинальных дисках с антителами. Протокол может быть использован, чтобы рассекать имагинальные диски от младшего личинок первой и второй возрастной стадии а. Преимущество этого протокола является то, что она является относительно коротким, и он имеет бытьан оптимизирован для сохранения высокого качества из рассеченной ткани. Еще одним преимуществом является то, что процедура фиксации, который используется хорошо работает с подавляющим числом антител, которые распознают Drosophila белки. По нашему опыту, есть очень небольшое количество чувствительных антител, которые не очень хорошо работают с этой процедурой. В таких ситуациях, появится средство, чтобы быть использовать альтернативный коктейль фиксации, продолжая следовать указаниям, которые мы, предъявляемым к шагов рассечение и инкубации антител.
Introduction
Для более века плодовой мушки, дрозофилы, был главным система для изучения развития, поведение и физиологию. Развитие в лету можно разделить на две большие стадии: эмбриональных и пост-эмбриональных с большей частью последнего, происходящих в монослоя эпителия называемых имагинальные диски 1-3. Чертежи имагинальных дисках были впервые опубликованы в 1864 году Августом Вейсмана в рамках своего широкого монографии о развитии насекомых 1. Эти диски начинают свое развитие во время эмбриогенеза, по образцу в течение личиночной стадии, пережить массовое гистолиза ранних куколки, и в конечном итоге привести к высоким процентом взрослых структур, которые находятся в пределах взрослой мухи 1-14. Во время развития личинок каждый диск делает несколько важных решений относительно судьбы, формы и размера. В первом и втором личиночных возрастов, диски поручено принятия первичный судьбу, establisповесят границы отсека, приняв правильную форму и генерации необходимого количества клеток 15-16. Во время третьего личиночного возраста и ранней стадии предварительного куколки, имагинальные диски продолжают делиться и с рисунком, как клетки принять свои терминальные судьбы 16.
В ранней истории Drosophila биологии развития, имагинальные диски были изучены почти исключительно в контексте нормального развития и в ограниченных случаях, когда утрата или усиления из-функции мутант жизнеспособным. Использование рентгеновских лучей, чтобы побудить митотический рекомбинации позволило летальных мутаций, которые будут проанализированы в клеточных клонов в рамках взрослой и личиночной тканей. Этот метод был усовершенствован путем введения трансгенных методов для анализа потерь и получить-из-функции мутации в обеих личинок и взрослых тканей. Количество антитела, транскрипционных репортеров и белка ловушки для описания молекулярной ландшафт дикого типа и мутантных тканей также строительстваantly растет. Используя эти молекулярные маркеры для анализа потерь и получить-из-функции мутант клонов клеток сделало более целесообразным, чтобы получить в режиме реального времени понимание того, как мутантные клетки отклоняются от своих диких родственников типа в процессе разработки. Чтобы правильно воспользоваться этими инструментами и реагентов важно иметь качественные препараты имагинальных дисках, которые можно просматривать, сфотографировали и проанализированы. Цель этой рукописи является обеспечение оптимизированный протокол для выделения и подготовки глаз-усиков диска комплекса (Рисунок 1А). Она также может быть успешно использован для выделения широкий спектр дополнительных дисков, включая те, которые приводят к возникновению крылья, жужжальцам, T1-T3 ног и половых органов (Рисунок 1В-E). Эта процедура, с незначительными изменениями, был использован для изоляции имагинальные диски из Drosophila в течение почти восьмидесяти лет.
Как описано выше, так как большинство гены экспрессируются во муltiple стадиях развития и в множестве тканей, часто невозможно, чтобы изучить эффекты, что нулевые мутанты имеют на всей глазом как животное умирает задолго до третьего возраста личиночной стадии. Четыре метода сделали изучение более развитых тканей, таких как сетчатка значительно более сговорчивым. Первым из них является метод Flippase (ФЛП) / Flippase рекомбинация Целевая (FRT) генерировать мутантных клонов клеток в противном случае дикого типа ткани 17-19. В данном случае мутантный ткань идентифицированы по отсутствию визуального маркера, такие как зеленый флуоресцентный белок (GFP) и его можно сравнить с окружающей ткани дикого типа, в которых присутствует GFP (2D) Рис. Второй метод "ар-аут", в котором трансген экспрессируется в популяции клеток 20. В этом случае клеточные клоны идентифицируются наличием GFP и по сравнению с окружающим дикого типа ткани, которая испытывает недостаток в GFP репортер (Рисунок2E). Третий является анализ Мозаика с репрессируемый сотовый Маркер (MARCM) техники, которая сочетает в себе элементы мутантного клона ФЛП / FRT и ФЛП-из выражений систем 21. С помощью этого метода трансген может быть выражена в популяции клеток, которые одновременно мутанта для индивидуального генетического локуса. Как ФЛП-из клонов, MARCM клоны идентифицируются наличием GFP и по сравнению с окружающим дикого типа ткани, которая испытывает недостаток в GFP маркер (Рисунок 2F). И, наконец, гены и РНК-интерференции конструкции могут быть выражены в имагинальных тканей под контролем конкретных промоутер-GAL4 конструкций. Эти четыре метода увеличили интерес к изучению имагинальные диски с мутантные или Сверхэкспрессия клоны или узоры можно напрямую сравнивать с соседней дикого типа ткани. Метод, описанный в этой процедуре была разработана таким образом, что исследователи, изучающие постэмбрионального развития взрослых тканях у дрозофилы,особенно те, которые получены из глаз-усиков диска, смогут получить качественное ткани для анализа. Хотя отдельные исследователи сделали небольшие изменения, в основе этой процедуры (которые мы опишем здесь) остается практически неизменным. После получения высокого качества ткани имеет решающее значение для изучения имагинальных дисков мы надеемся, что это написано протокол и сопровождающие видео будет служить в качестве ценного учебного ресурса.
Protocol
Representative Results
Discussion
Хотя эта процедура в значительной степени сосредоточены на изоляции и последующего лечения глазных-усиков дисков, она поддается используется выделить и проанализировать крыло, haltere, ногу и генитальные диски (Рисунок 4). Единственным обязательным модификация протокола для выд…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы хотели бы поблагодарить Дональда Ready и Кевин Моисею для обучения JPK оригинальный имагинальную процедуру диск рассечение. Мы также благодарим Бонни Weasner для половых диска в рисунке 1b и глаз диска в рисунке 2А, Брэндон Weasner для рисунке 3, Блумингтон дрозофилы со Центр лету пятен и Развивающие Исследования Hybridoma банк антител. CMS была поддержана стипендией от Национальных институтов здравоохранения (NIH) GCMS подготовки Гранта (T32-GM007757), Фрэнк У. Патнэм исследовательский грант, и исследовательский грант Роберт Бриггс. JPK поддерживается грантом Национального института глаза (R01 EY014863)
Materials
| Name of Material/Equipment | Company | Catalog Number | Comments |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | Used to create base for dissection plate |
| Pryex Glass Petri Dish 150x20mm | Dow Corning | 3160-152CO | Use the cover for dissection plate |
| #5 Dissecting Forceps | Ted Pella | 525 | Forceps must be kept very sharp |
| 9 well watch glass | Vairous Vendors | N/A | Used for fixation of imaginal disc complexes |
| 50ml Erlenmeyer Flask | Various Vendors | N/A | |
| Small Stir Bar | Various Vendors | N/A | Small enough to fit into Erlenmeyer Flask |
| 50ml Conical Tubes | Various Vendors | N/A | |
| 1.5ml Microfuge Tubes | Various Vendors | N/A | Clear or Dark depending upon application |
| Microfuge Rack | Various Vendors | N/A | |
| Benchtop Rotator | Various Vendors | N/A | 100ul volume should not splatter at low setting |
| Paraformaldehyde | Macron Chemicals | 2-26555-1 | Serves as fixative |
| Sodium Phosphate Monobasic | Sigma Chemical Co | S-3139 | Used to make dissection and wash buffers |
| Sodium Phosphate Dibasic | Sigma Chemical Co | 71636 | Used to make dissection and wash buffers |
| Lysine | Acros Organics | 125221000 | Used in the fixative solution |
| Sodium Periodate | Sigma Chemical Co | S-1878 | Used in the fixative solution |
| Triton X-100 | EMD Chemicals | MTX1568-1 | Used to perforate imaginal discs |
| Sodium Hydroxide | EM Science | SX0593-3 | Used to dissolve paraformaldehyde |
| 100% Normal Goat Serum` | Jackson Laboratories | 005-000-121 | Serves as a blocking solution |
| Primary Antibodies | Various Vendors | N/A | Dilute in 10% goat serum as directed by manufacturer |
| Seondary Antibodies | Various Vendors | N/A | Dilute in 10% goat serum as directed by manufacturer |
| Vectashield | Molecular Probes | H-1000 | Prevents bleaching of samples |
| Microscope Slides | Fischer Scientific | 48312-003 | |
| Glass Cover Slips 18x18mm | Fischer Scientific | 12-542A | |
| Kimwipe Tissue | Various Vendors | NA | Prevents Glass slides from adhering to silicone base |
| Panit Brush 000 | Various Vendors | NA | Use to gently lower coverslip on to samples |
References
- Weismann, A. Die nachembryonale entwicklung der Musciden nach beobachtungen an Musca vomitoria und Sarcophaga carnaria. Zeit. Wiss. Zool. 14, 187-336 .
- Cohen, S. M. . Imaginal disc development. , 747-841 (1993).
- Held, L. I. Imaginal Discs: The Genetic and Cellular Logic of Pattern Formation. Developmental and Cell Biology Series. 39, 460 (2002).
- Miall, L. C., Hammond, A. R. The development of the head of the imago of Chironomus. Trans. Linn. Soc. Zool. 5, 265-279 .
- Kellog, V. L. The development and homologies of the mouth parts of insects. Am. Nat. 36, 683-706 (1902).
- Eassa, Y. E. E. The development of imaginal buds in the head of Pieris brassicae Linn. (Lepidoptera). Trans. R. Entomol. Soc. Lond. 104, 39-51 (1953).
- Bryant, P. J., Schneiderman, H. A. Cell lineage, growth, and determination in the imaginal leg discs of Drosophila melanogaster. Dev Biol. 20, 263-290 (1969).
- Postlethwait, J. H., Schneiderman, H. A. A clonal analysis of development in Drosophila melanogaster: morphogenesis, determination and growth in the wild type antenna. Dev. Biol. 24, 477-519 (1971).
- Anderson, D. T., Counce, S., Waddington, C. H. The development of hemimetabolous insects. Developmental Systems. , 165-242 (1972).
- Anderson, D. T., Counce, S., Waddington, C. H. The development of hemimetabolous insects. Developmental Systems. , 96-163 (1972).
- Crick, F. H. C., Lawrence, P. A. Compartments and polyclones in insect development. Science. 189, 340-347 (1975).
- Wieschaus, E., Gehring, W. Clonal analysis of primordial disc cells in the early embryo of Drosophila melanogaster. Dev Biol. 50 (2), 249-263 (1976).
- Lawrence, P. A., Morata, G. The early development of mesothoracic compartments in Drosophila. An analysis of cell lineage and fate mapping and an assessment of methods. Dev Biol. 56 (1), 40-51 (1977).
- Madhaven, M. M., Schneiderman, H. A. Histological analysis of the dynamics of growth of imaginal discs and histoblast nests during the larval development of Drosophila melanogaster. Wilhelm Roux Archive. 183, 269-305 (1977).
- Kumar, J. P. Retinal determination the beginning of eye development. Curr Top Dev Biol. 93, 1-28 (2010).
- Kumar, J. P. My what big eyes you have: how the Drosophila retina grows. Dev Neurobiol. 71 (12), 1133-1152 (2011).
- Golic, K. G., Lindquist, S. The FLP recombinase of yeast catalyzes site-specific recombination in the Drosophila genome. Cell. 59, 499-509 (1989).
- Xu, T., Rubin, G. M. Analysis of genetic mosaics in developing and adult Drosophila tissues. Development. 117 (4), 1223-1237 (1993).
- Duffy, J. B., Harrison, D. A., Perrimon, N. Identifying loci required for follicular patterning using directed mosaics. Development. 125 (12), 2263-2271 (1998).
- Ito, K., et al. The Drosophila mushroom body is a quadruple structure of clonal units each of which contains a virtually identical set of neurones and glial cells. Development. 124 (4), 761-771 (1997).
- Lee, T., Luo, L. Mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) for Drosophila neural development. Trends Neurosci. 24, 251-254 (2001).
- Ready, D. F., Hanson, T. E., Benzer, S. Development of the Drosophila retina, a neurocrystalline lattice. Dev. Biol. 53, 217-240 (1976).
- Wolff, T., Ready, D. F. The beginning of pattern formation in the Drosophila compound eye: the morphogenetic furrow and the second mitotic wave. Development. 113, 841-850 (1991).
- Heberlein, U., Wolff, T., Rubin, G. M. The TGF beta homolog dpp and the segment polarity gene hedgehog are required for propagation of a morphogenetic wave in the Drosophila retina. Cell. 75, 913-926 (1993).
- Ma, C., et al. The segment polarity gene hedgehog is required for progression of the morphogenetic furrow in the developing Drosophila eye. Cell. 75, 927-938 (1993).
- Heberlein, U., et al. Growth and differentiation in the Drosophila eye coordinated by hedgehog. Nature. 373, 709-711 (1995).
- Dominguez, M., Hafen, E. Hedgehog directly controls initiation and propagation of retinal differentiation in the Drosophila eye. Genes Dev. 11, 3254-3264 (1997).
- Pignoni, F., Zipursky, S. L. Induction of Drosophila eye development by Decapentaplegic. Development. 124, 271-278 (1997).
- Borod, E. R., Heberlein, U. Mutual regulation of decapentaplegic and hedgehog during the initiation of differentiation in the Drosophila retina. Dev. Biol. 197, 187-197 (1998).
- Masucci, J. D., Miltenberger, R. J., Hoffmann, F. M. Pattern-specific expression of the Drosophila decapentaplegic gene in imaginal disks is regulated by 3′ cis-regulatory elements. Genes Dev. 4, 2011-2023 (1990).
- Blackman, R. K., et al. An extensive 3′ cis-regulatory region directs the imaginal disk expression of decapentaplegic, a member of the TGF-b family in Drosophila. Development. 111, 657-665 (1991).
- Campos, A. R., et al. Molecular analysis of the locus elav in Drosophila melanogaster: a gene whose embryonic expression is neural specific. Embo J. 6 (2), 425-431 (1987).
- Robinow, S., White, K. The locus elav of Drosophila melanogaster is expressed in neurons at all developmental stages. Dev Biol. 126 (2), 294-303 (1988).
- Kumar, J. P. Building an ommatidium one cell at a time. Dev Dyn. 241 (1), 136-149 (2012).
- Kimmel, B. E., Heberlein, U., Rubin, G. M. The homeo domain protein rough is expressed in a subset of cells in the developing Drosophila eye where it can specify photoreceptor cell subtype. Genes Dev. 4 (5), 712-727 (1990).
- Dokucu, M. E., Zipursky, S. L., Cagan, R. L. Atonal, rough and the resolution of proneural clusters in the developing Drosophila retina. Development. 122 (12), 4139-4147 (1996).
- Kumar, J. P., Moses, K. M. EGF Receptor and Notch signaling act upstream of Eyeless/Pax6 to control eye specification. Cell. 104, 687-697 (2001).
