Produktion og Isolering af Axoner fra sensoriske neuroner for Biokemisk Analyse Brug porøse filtre

Summary

This article describes a neuronal culture system that can be used to obtain large quantities of pure axonal samples for biochemical and immunocytochemical analyses. This technique will allow an improved understanding of normal axonal physiology and signaling pathways leading to neurodegeneration.

Abstract

Neuronal axons use specific mechanisms to mediate extension, maintain integrity, and induce degeneration. An appropriate balance of these events is required to shape functional neuronal circuits. The protocol described here explains how to use cell culture inserts bearing a porous membrane (filter) to obtain large amounts of pure axonal preparations suitable for examination by conventional biochemical or immunocytochemical techniques. The functionality of these filter inserts will be demonstrated with models of developmental pruning and Wallerian degeneration, using explants of embryonic dorsal root ganglion. Axonal integrity and function is compromised in a wide variety of neurodegenerative pathologies. Indeed, it is now clear that axonal dysfunction appears much earlier in the course of the disease than neuronal soma loss in several neurodegenerative diseases, indicating that axonal-specific processes are primarily targeted in these disorders. By obtaining pure axonal samples for analysis by molecular and biochemical techniques, this technique has the potential to shed new light into mechanisms regulating the physiology and pathophysiology of axons. This in turn will have an impact in our understanding of the processes that drive degenerative diseases of the nervous system.

Introduction

Den aksonal rum af neuroner, viser en stor grad af funktionel uafhængighed af somato-dendritiske rum. I projektion neuroner axoner indeholder det meste af den neuronale protein ^1,2. Studiet af fysiologi og patofysiologi af axoner har vundet momentum i neurovidenskab samfund, fordi de seneste undersøgelser har vist, at tidlig axonal dysfunktion synes at være et fælles træk ved neurodegenerative sygdomme og neuropsykiatriske lidelser ^3. Det forekommer sandsynligt, at en bedre forståelse af axonale-eksklusiv mekanismer under normale og patologiske tilstande vil kaste lys over de tidlige hændelser, der driver dysfunktion.

Den nuværende protokol beskriver, hvordan kultur indsætter bærer en porøs membran (filter) for at opnå store mængder af ren axonal materiale, der er egnet til biokemiske og immunocytokemiske analyser. Brugen af ​​Filterindsatserne at studere aksonal biologi blev først gennemført af Steward ogkolleger ⁴ og yderligere udviklet af Twiss og kolleger ⁵ til dens nuværende konfiguration. Teknikken er nu i brug af grupper, der studerer forskellige aspekter af aksonal og dendritceller biologi, med mindre ændringer i hvert tilfælde til at rumme for populationen af neuroner studeret, de udførte behandlinger og typen af biokemiske analyser anvendte ^6-9. Den nuværende protokol har ikke til hensigt at rumme alle de alternativer til sådan en bred vifte af applikationer, men snarere give en enkel tilgang, der er velegnet til de fleste anvendelser. Især protokollen beskrevet her bruger en tredobbelt belægning, der maksimerer axonal udbytte biokemiske analyser og er bedst egnet til at studere axonale degeneration-andre belægninger, der er beskrevet i litteraturen producerede færre axoner, der oprulles og udarte hurtigere, når frataget fra trofiske ⁹ faktorer.

I denne fremgangsmåde forbliver nervecellelegemer isoleret oven på filtrer while axoner passere gennem porerne og vokse langs dens bundflade. Pure axoner (gratis glia og neuronale celle krop forureninger), der vokser på undersiden af filteret kan indsamles til biokemiske analyser eller kan fastgøres på stedet og undersøgt af immuncytokemiske teknikker ^9. Fremgangsmåden bygger på anvendelsen af ​​embryonale sensoriske neuroner fra den dorsale rodganglie (DRG). Embryonale DRG er almindeligt anvendt til at studere axonal biologi fordi neuritter fra disse celler undergår hurtig og robust vækst in vitro, når fastholdt i nervevækstfaktor (NGF), og fordi de hurtigt undergår degeneration, når frataget denne faktor. Også DRG neuroner mangler dendritter, så alle neurites indsamlet af denne metode er rent axoner.

Filterindsatserne repræsenterer en stor fordel i forhold til andre tilgange, der anvendes til at studere axoner. Undersøgelser, der kræver anvendelse af mikroskopi for at differentiere processer forekommer i cellen soma fra dem i enXON'er giver begrænset biokemisk information. Som et andet eksempel opdelte kultur systemer (f.eks Campenot kamre ¹⁰ eller mikrofluidenheder ¹¹⁾ er nyttige for billedteknik og differentieret behandling af celle rum, men giver kun små mængder af axonal materiale, hvilket udelukker brugen af disse teknikker til biokemiske analyser, som kræver relativt store mængder prøve. Yderligere, deres anvendelse kræver betydelig træning samt specialiserede enheder, og de er tidskrævende. En anden tilgang, der ofte bruges til at isolere axoner fra explanter er manuelt at fjerne en explant center (indeholdende nervecellelegemer) før axonal prøvetagning. Selv om dette kan producere store mængder af Axon-berigede præparater, kan axoner i dette præparat være indhyllet i glia og hurtigt fjerne 20 eksplantatkulturer organer fortløbende 6 brønde (som et eksempel på en minimal eksperiment) er tidskrævende og på grænsen af ​​gennemførlighed.

I modsætning hertil metode præsenteres her producerer rigelige og rene axonale præparater, som derefter kan analyseres ved næsten enhver biokemisk teknik, der er almindeligt anvendt til at analysere helcellelysater som western blot, immunfældning ^6, northern blot ⁵ massespektrometri ^6, RNA oprensning ^7,12,13, blandt andre. Desuden kan protokollen anvendes på immunfluorescens (IF)-teknikker, som det er muligt at fastsætte axoner vokser i bunden af ​​filteret til yderligere at undersøge dem ved IF. Denne fremgangsmåde letter i høj grad analysen af ​​axonal-specifikke processer, da der ikke er nogen cellelegemer i det endelige præparat. Dette er en betydelig fordel, da en høj immunofluorescent signal fra cellelegemer underminerer ofte undersøgelse og analyse af en svagere signal, der stammer fra tynde strukturer såsom axoner.

To anvendelser af kulturen metode til at studere aksonal degeneration are beskrevet; en model af udviklingsmæssig beskæring og en model af skade-induceret degeneration (almindeligvis kaldet Wallerian degeneration). Modellering af udviklingsmæssige beskæring er baseret på det faktum, at sensoriske neuroner in vivo konkurrere om at begrænse mængden af mål-afledt NGF og dem ikke at modtage nok neurotrof støtte degenereret ^14. Dette fænomen kan efterlignes i embryoniske DRG-kulturer ved at trække NGF fra dyrkningsmediet, der, som sker in vivo, initierer axonal degenerering efterfulgt af celledestruktion krop. For at modellere Wallerian degeneration, er oversiden af ​​filteret med cellelegemer skrabet væk. Axoner, der var dyrket på bunden af filteret bliver fysisk adskilt fra cellelegemerne og derefter underkastes en hurtig og stereotyp degenerative proces kendt som Wallerian degeneration ^15, opkaldt efter A. Waller, som først rapporteret fænomenet i 1850 ^16.

Protocol

BEMÆRK: De følgende procedurer er i overensstemmelse med retningslinjer godkendt af den canadiske Rådet for Animal Care. Gøres alle bestræbelser på at mindske smerter og angst af dyr under procedurer. 1.. Coating af filtre BEMÆRK: Når kulturen filterindsatse er placeret i brønde i multi-brøndplader, to rum defineret: øverste rum er området over indsatsen og nederste rum er den nedenfor indsatsen Figur 1A.ab. Eksplantater udsås i den ø…

Representative Results

Dorsalrodsganglieceller eksplanteret fra E13.5 mus vokse udførligt om filtre belagt sekventielt med poly-D-lysin, laminin og kollagen (figur 1B, til venstre), og nåede op til 2 mm inden for 2 dage i kultur. Dette substrat kombination giver særligt sprudlende vækst; andre kombinationer giver axoner, der er betydeligt kortere (figur 1B, højre). Desuden DRG vedligeholdes på filtre udvide flere og længere axoner end DRG dyrket på plast figur 1C. <p class="jove_c…

Discussion

Vigtige parametre at tage hensyn til ved at tilpasse denne teknik omfatter neuronale befolkning, der vil blive undersøgt, underlaget, porestørrelse af filteret og areal. Alle disse parametre vil påvirke specificitet, kvaliteten og mængden af ​​det neurite forberedelse fremstillet, og skal overvejes nøje af slutbrugeren. I eksemplerne i denne protokol, brug af DRG neuroner har den fordel af at udvide kun axoner, hvilket giver en ren (specifik) axonal forberedelse.

Aksonal vækst af e…

Materials

CD-1 mouse, E13 timed pregnancy	Charles River		In house timed pregnancies can be done by mating mice and checking for vaginal plugs (Day E0)
Falcon Cell Culture Inserts	Corning	353102	1 µm pore size, fits 6-well receiving plate
Falcon Cell Culture Companion Plates	Corning	353502	Receiving plates for inserts
Poly-D-Lysine	Sigma-Aldrich	P6407	Used at 1 mg/ml in water. Can re-use once.
Laminin	Sigma-Aldrich	L2020	Used at 10 ug/ml in water. Take 100X stock from -80 °C and thaw overnight at 4 °C
PureCol Bovine Collagen Solution	Advanced Biomatrix	5005-B
Leibovitz's L-15 Medium	Invitrogen	11415-064	Can be replaced by DMEM.
Neurobasal Medium	Invitrogen	21103-049
B-27 Serum-Free Supplement	Invitrogen	17504-044
5-Fluoro-2′-deoxyuridine (FDU)	Sigma-Aldrich	F0503
NGF (2.5S, beta subunit)	Cedarlane	CLMCNET-001
Anti-NGF Antibody	Prepared in-house	–	As described in: Acheson, A., Barker, P.A., Alderson, R.F., Miller, F.D. & Murphy, R.A. Detection of brain-derived neurotrophic factor-like activity in fibroblasts and Schwann cells: inhibition by antibodies to NGF. Neuron.7, 265-75, (1991)
	Alomone Labs	AN-240	Commercial option
Anti-Tubulin Antibody	Millipore	MAB5564
Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse Antibody	Invitrogen	A-11029
DRG culture medium
Neurobasal Medium 2 % B27 Neurobasal Supplement 2 mM l-Glutamine 1 % Penicillin-Streptomysin 10 µM FDU 15 ng/ml NGF (bottom compartment only)
1X Laemmli Sample Buffer
10 % SDS 0.5 M DTT 0.5 M Tris (pH 6.8) 5 % Glycerol 0.01 % (w/v) Bromophenol blue