Быстрое Анализ хромосомных аберраций в Mouse-лимфоцитов на PNA-FISH
Summary
Восстановления повреждений ДНК имеют важное значение для поддержания геномной целостности и предотвращения мутации и рак. Цель этого протокола заключается в количественном нестабильность генома путем прямого наблюдения хромосомных аберраций в метафазных из В-клеток мыши, используя флуоресцентные в гибридизация (FISH) для повторов теломер ДНК.
Abstract
Неисправный репарации ДНК приводит к увеличению нестабильности генома, которая является причиной мутаций, которые приводят к туморогенеза. Анализ частоты и типа хромосомных аберраций в клетках различных типов позволяет дефекты восстановления повреждений ДНК не выяснены. Понимание млекопитающих репарации ДНК биология была очень помог производства мышей с нокаутом в специфических генов. Цель этого протокола заключается в количественном геномной нестабильности в мышь-лимфоцитов. Маркировка теломер с использованием PNA-FISH зондов (пептид нуклеиновых кислот – флуоресцентные в гибридизация) способствует быстрому анализ геномной нестабильности в спредов метафазных хромосом. В-клетки имеют определенные преимущества по сравнению с фибробластами, потому что они имеют нормальную плоидности и более высокий митотический индекс. Краткосрочная культура клеток, следовательно, позволяет точное измерение геномной нестабильности в первичной клеточной популяции, которая, вероятно, имеют меньше вторичного генетическую мутациюс чем то, что, как правило, находится в трансформированных фибробластов линии клеток или пациента.
Introduction
Рак вызывается к накоплению мутаций, влияющих на гены, которые регулируют нормальный рост клеток. Мутация является следствием изменений в структуре и последовательности генома, связанная с повреждением ДНК. Повреждение ДНК может происходить с помощью различных процессов, в том числе экзогенных агентов, таких как ионизирующее излучение, и в качестве побочного продукта нормального клеточного метаболизма, такие как спонтанного дезаминирования нуклеотидных оснований или повреждений, возникающих при контакте с активными формами кислорода 1.
Хотя клетки млекопитающих обладают ряд мероприятий по ремонту, которые могут повернуть вспять повреждение ДНК или восстановить последовательность в местах разрыва, мутации, тем не менее накапливаются в течение всей жизни клетки. Повреждение ДНК может, кроме того, способствуют старению и потере активности стволовых клеток, два процесса, которые связаны с старение-ассоциированных заболеваний 2. Понимание ремонт повреждения ДНК, таким образом, решающее значение в решении две знакificant вопросы в области общественного здравоохранения. Увеличение данные свидетельствуют о том, что млекопитающих пути репарации ДНК может способствовать эволюции раковых клеток геном 3,4, что делает его еще более важно для понимания процессов, участвующих в подавлении мутации на молекулярном уровне.
Прямая визуализация хромосомных аберраций является мощным и количественные средства определения степени геномной нестабильности в конкретном типе клеток. Сокращенные хромосомы клеток в метафазе, могут быть выделены и проверены с помощью света или флуоресцентной микроскопии. Такие подходы цитогенетических был на практике в течение нескольких десятилетий и может быть использован, чтобы продемонстрировать внешний вид транслокаций или конкретных видов хромосомных аберраций, связанных с потерей репарации ДНК деятельности. Протокол поддается нескольких потенциальных расширений: хромосомы могут быть помечены зондов для спектрального кариотипирование (SKY) или многоцветной флуоресцентной гибридизации на месте(MFISH) для выявления транслокации 5,6. Эти методы также позволяют частоту хромосомных транслокаций и структуры сложных хромосомных транслокаций, которые будут определены, что обеспечивает дополнительную информацию сверх того, что можно с этим протоколом. Кроме того, последовательность конкретных зонды могут быть получены и использованы для тестирования частоты разрыва ДНК в отдельных геномных сайтов 7.
В этом протоколе, мы опишем приготовление метафазных хромосом распространяется от В-лимфоцитов. Флуоресцентно-меченного пептида нуклеиновой кислоты (ПНК) зонд для теломерных повторов используется, которые эффективно отмечает теломеры в метафазе хромосомы распространяется Этот протокол имеет несколько преимуществ. В-клетки могут быть индуцированы расти при высокой митотический индекс, так что высококачественные спреды последовательно, может быть получено. В-клетки генетически модифицированных мышей, также гораздо реже содержат вторичные генетические мутации, которые могут посрамить анализ вкладаспецифических генов в геномной целостности. Подход PNA-FISH может быть завершена в течение одного дня, и позволяет более точно озвучивание разрывы хромосом. Используя этот подход, особенно в сочетании с конкретного оборудования, описанного в этом протоколе, можно производить очень последовательные, высококачественные спреды и быстро анализировать частоту и тип геномной нестабильности.
Protocol
Representative Results
Discussion
В то время как активированные лимфоциты особенно подходит для приготовления митотических хромосом спредов, другие типы клеток, также могут быть использованы. Т-лимфоциты имеют много преимуществ В-клеток, так как они могут быть очищены из селезенки или лимфатических узлов, а также имею…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа поддерживается NIH грант R00 CA160574 (SFB) и с помощью общения Программы Рутгерса биотехнологии подготовки (к SMM).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 50% Dextran sulfate | Intergen | S4030 | |
| Deionized formamide | Ambion | 9342 | |
| Pepsin (5g) | Sigma | P 6887 | |
| FCS | Gemini | 100-106 | |
| LPS (100mg) | Sigma | L2630 | |
| IL-4 (5μg) | Sigma | I1020 | |
| PNA Telomere Probe | PNA Bio Inc | F1002 | (CCCTAACCCTAACCCTAA) |
| Colcemid | Roche | 295892 | |
| Mowiol 4-88 | Sigma | 81381-50g | |
| CD43 (ly-48_) micro-beads | Miltenyl Biotec. | 130-049-801 | |
| DAPI | Sigma | 32670-5MG | |
| Eclipse E800 | Nikon | ||
| AxioImager.Z2 | Zeiss | ||
| CDS-5 Cytogenetic Drying Chamber | Thermotron |
References
- Sancar, A., Lindsey-Boltz, L. A., Unsal-Kacmaz, K., Linn, S. Molecular mechanisms of mammalian DNA repair and the DNA damage checkpoints. Ann Rev Biochem. 73, 39-85 (2004).
- Sperka, T., Wang, J., Rudolph, K. L. DNA damage checkpoints in stem cells, ageing and cancer. Nature reviews Mol Cell Biol. 13 (9), 579-590 (2012).
- Alexandrov, L. B., et al. Signatures of mutational processes in human cancer. Nature. 500 (7463), 415-421 (2013).
- Bunting, S. F., et al. 53BP1 inhibits homologous recombination in Brca1-deficient cells by blocking resection of DNA breaks. Cell. 141 (2), 243-254 (2010).
- Padilla-Nash, H. M., Barenboim-Stapleton, L., Difilippantonio, M. J., Ried, T. Spectral karyotyping analysis of human and mouse chromosomes. Nat Protoc. 1 (6), 3129-3142 (2006).
- Callen, E., et al. Chimeric IgH-TCRalpha/delta translocations in T lymphocytes mediated by RAG. Cell Cycle. 8 (15), 2408-2412 (2009).
- Boboila, C., et al. Alternative end-joining catalyzes robust IgH locus deletions and translocations in the combined absence of ligase 4 and Ku70. Natl Acad Sci USA. 107 (7), 3034-3039 (2010).
- Benn, P., Delach, J. Human lymphocyte culture and chromosome analysis. Cold Spring Harb Protoc. 2008, (2008).
- Nguyen, H. N., Reijo Pera, R. A. Metaphase spreads and spectral karyotyping of human embryonic stem cells. Cold Spring Harb Protoc. 2008, (2008).
- Schreck, R. R., Disteche, C. M. Chapter 4. Chromosome banding techniques. Unit 2, (2001).
- Gilley, D., et al. DNA-PKcs is critical for telomere capping. Proc Natl Acad Sci USA. 98 (26), 15084-15088 (2001).
- Bolzan, A. D. Chromosomal aberrations involving telomeres and interstitial telomeric sequences. Mutagenesis. 27 (1), 1-15 (2012).
- Bolzan, A. D., Telomeres Bianchi, M. S. interstitial telomeric repeat sequences and chromosomal aberrations. Mutat Res. 612 (3), 189-214 (2006).
- Poon, S. S., Lansdorp, P. M. Chapter 18. Quantitative fluorescence in situ hybridization (Q-FISH). Unit 18 14, (2001).
- Morales, J. C., et al. 53BP1 and p53 synergize to suppress genomic instability and lymphomagenesis. Proc Natl Acad Sci USA. 103 (9), 3310-3315 (2006).
- Halaby, M. J., et al. Synergistic interaction of Rnf8 and p53 in the protection against genomic instability and tumorigenesis. PLoS Genet. 9 (1), e1003259 (2013).
