Differentiation of precursor cells into osteoclasts is regulated by cytokines and growth factors. Here, a novel gene transfer technique for differentiation of osteoclasts in vivo and cell culture protocols for differentiating precursor cells into osteoclasts in vitro as a method to study the effects of cytokines on osteoclastogenesis are described.
Differentiation and activation of osteoclasts play a key role in the development of musculoskeletal diseases as these cells are primarily involved in bone resorption. Osteoclasts can be generated in vitro from monocyte/macrophage precursor cells in the presence of certain cytokines, which promote survival and differentiation. Here, both in vivo and in vitro techniques are demonstrated, which allow scientists to study different cytokine contributions towards osteoclast differentiation, signaling, and activation. The minicircle DNA delivery gene transfer system provides an alternative method to establish an osteoporosis-related model is particularly useful to study the efficacy of various pharmacological inhibitors in vivo. Similarly, in vitro culturing protocols for producing osteoclasts from human precursor cells in the presence of specific cytokines enables scientists to study osteoclastogenesis in human cells for translational applications. Combined, these techniques have the potential to accelerate drug discovery efforts for osteoclast-specific targeted therapeutics, which may benefit millions of osteoporosis and arthritis patients worldwide.
Musculoskeletale aandoeningen invloed op miljoenen mensen in de Verenigde Staten en de huidige ernstige gevolgen voor de nationale en lokale systemen gezondheid 1. Deze aandoeningen worden gekenmerkt door het verlies van bot-en gewrichtsziekten functie die uitgebreide behandeling en lange periodes van herstel nodig hebben. Gewoonlijk, een relatieve toename van het aantal en / of activiteit van osteoclasten, cellen gespecialiseerd bot resorberen, bij osteoporose en artritis waargenomen 2. Onder fysiologische omstandigheden het aantal en de activiteit van osteoclasten wordt geregeld door receptor activator van nucleaire factor κ B-ligand (RANKL), die wordt geproduceerd door osteoblasten. Osteoprotegerine (OPG), is een decoy receptor voor RANKL ook geproduceerd door osteoblasten 3 In vivo diermodellen dat de systemische overexpressie van sRANKL, of verwijdering van OPG betrokken zijn zeer waardevol bij osteoporose onderzoek.; Deze werkwijzen vereisen het genereren van transgene muizen 4,5. Hier, een nieuw alternatiefWerkwijze overexpressie sRANKL voor de studie van spier-gerelateerde stoornissen beschreven. Specifiek minicircle (MC)-DNA-technologie en hydrodynamische levering methoden werden gebruikt om genoverdracht van sRANKL in vivo te bereiken en overexpressie muis sRANKL systemisch 6.
Deze methode is ook een aanvulling op andere in vivo modellen van osteoporose, zoals hormonale modulatie van osteoclasten na ovariëctomie 7 en dieetinterventie door laag-calcium dieet 8. Deze modellen zijn zeer nuttig om de verschillende aspecten van het bewegingsapparaat gerelateerde stoornissen maar ze chirurgische procedures vereisen en kan tot enkele maanden, tegen aanzienlijke kosten 9 bestuderen. Ovariëctomie (OVX) knaagdier model is een proefdiermodel waar verwijdering van de eierstokken leidt tot een tekort aan oestrogeen waardoor de menselijke postmenopauzale osteoporose 10 nabootsen. Human postmenopauzale osteoporose, een aandoening waarbij oestrogeen Deficirantie leidt tot een verhoogd risico op botbreuken en osteoporose treft ongeveer acht miljoen vrouwen in de Verenigde Staten alleen. Hoewel de OVX model is handig voor postmenopauzale osteoporose biedt beperkte voordelen in het bestuderen van osteoporose in het algemeen. Oestrogeen onderdrukt botverlies, door het induceren van osteoclasten en osteoblasten remmen apoptose, derhalve in zijn afwezigheid een verhoogde activiteit van de osteoclasten wordt waargenomen 10-12. Een RANKL-OPG-ratio onbalans die botresorptie gunsten is ook waargenomen 13. Echter oestrogeendeficiëntie in vivo ook gepaard met verlaagde transformerende groeifactor β (TGF β), verhoogde interleukine-7 (IL-7) en TNF, IL-1 en IL-6 14,15. Aangezien deze cytokinen bekend botremodellering modulerende functies onafhankelijk van de RANKL-route, is het onmogelijk om eventuele osteoclast activering kenmerk uitsluitend de RANKL RANK-as. De in dit document beschreven model stelt onderzoekers in staat om te studeren in vivo RANKL-RANK as in osteoclastogenese en botverlies zonder pro-inflammatoire cytokines in vergelijking met OVX knaagdier modellen.
Bovendien, in vitro osteoclastogenese technieken zijn essentiële instrumenten om osteoclasten activering studeren voor potentiële therapeutische behandelingen van musculoskeletale aandoeningen. Eerdere studies hebben ook aangetoond dat het kweken van muizen beenmerg afgeleide macrofagen (BMMs), muis-macrofaag kolonie stimulerende factor (M-CSF) en muis sRANKL kan leiden tot differentiatie van osteoclasten 3,16,17. Hier, de protocollen meerkernige osteoclast-achtige cellen uit muizen beenmerg en uit humane perifere bloed mononucleaire cellen (PBMC) in vitro 18 genereren beschreven. Het celgebaseerde proeven vereist een volwassen terminaal gedifferentieerd en volledig functionele osteoclasten bepalen worden ook kort beschreven. Deze in vitro technieken aanvulling op de roman in vivo benadering en samen dienen als powerful onderzoeksinstrumenten om de differentiatie van osteoclasten en activering te bestuderen. Met deze systemen kunnen wetenschappers osteoclasten in vivo en in vitro genereren en bepalen de prikkels en signalen nodig zijn voor de proliferatie en activering en test de effectiviteit van farmacologische en biologische remmers.
Musculoskeletale aandoeningen zijn belangrijkste oorzaken van morbiditeit en invaliditeit en zijn samengesteld uit meer dan 150 ziekten en syndromen; die ongeveer 90 miljoen Amerikanen vandaag. Gewrichtsontsteking en botafbraak zijn overheersende kenmerken van musculoskeletale aandoeningen, met inbegrip van artritis en osteoporose. Osteoporose is een aandoening die bot integriteit verzwakt, wat vaak leidt tot breuken van het bot. Artritis is een chronische, invaliderende ziekte die wordt gekenmerkt door een ontsteking v…
The authors have nothing to disclose.
Research was partly supported by NIH research grants R01 AR062173 and SHC 250862 to IEA. ES is the recipient of NIH T32 CTSC predoctoral fellowship.
alpha-MEM | Life Technologies | 12561-056 | |
Human M-CSF | Miltenyi Biotec | 130-096-492 | |
Mouse M-CSF | Miltenyi Biotec | 130-094-643 | |
Human RANK-Ligand – soluble | Miltenyi Biotec | 130-094-631 | |
Mouse RANK-Ligand – soluble | Miltenyi Biotec | 130-094-076 | |
Tailveiner Restrainer for mice | Braintree | TV-150 STD | |
Mouse TRANCE/RANK L/TNFSF11 Quantikine ELISA Kit | R&D systems | MTR00 | |
Acid Phosphatase, Leukocyte (TRAP) Kit | Sigma | 387A | |
MouseTRAP assay | immunodiagnostic systems | SB-TR103 |