JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
자동 번역
생물학

Forbedret Northern Blot detektering af små RNA-art i<em> Drosophila melanogaster</em

Published: August 21, 2014
doi:
10.3791/51814
,
1Département de Génomique Fonctionnelle et Cancer,Institut de Génétique et de Biologie Moléculaire et Cellulaire, 2Center for Life NanoScience,Istituto Italiano di Tecnologia

Summary

Formålet med denne publikation er at visualisere og diskutere de operative trin i en Enhanced Northern blot protokol om RNA ekstraheret fra Drosophila melanogaster embryoner, celler og væv. Denne protokol er særligt anvendelige til effektiv detektering af små RNA-species.

Abstract

De sidste årtier har været vidne til eksplosionen af ​​videnskabelig interesse omkring genekspression kontrolmekanismer på RNA-niveau. Denne gren af ​​molekylær biologi har været stærkt næret af opdagelsen af ​​ikke-kodende RNA som vigtige aktører i posttranskriptionel regulering. Et sådant revolutionært perspektiv er blevet ledsaget og udløst af udviklingen af ​​kraftfulde teknologier til profilering korte RNA'er udtryk, både på højt gennemløb niveau (genom-dækkende identifikation) eller som enkelt-kandidat analyse (steady state ophobning af specifikke arter). Selv om flere state-of-art strategier er i øjeblikket tilgængelig for dosering eller visualisere sådanne flygter molekyler, Northern blot analysen forbliver den berettigede tilgang i molekylær biologi til øjeblikkelig og præcis evaluering af RNA-ekspression. Det udgør et første skridt hen imod anvendelsen af ​​mere avancerede, dyre teknologier og i mange tilfælde, er fortsat en privilegeret metode til nemt at få indsigttil RNA biologi. Her oversigt vi en effektiv protokol (Enhanced Northern blot) til påvisning af svagt udtrykt microRNA (eller andre små regulatoriske RNA arter) fra Drosophila melanogaster hele embryoner manuelt dissekeret larvernes / voksent væv eller in vitro-dyrkede celler. En meget begrænset mængde af RNA er påkrævet, og anvendelse af materiale fra flowcytometri-isolerede celler kan også overvejes.

Introduction

RNA-biokemi har oplevet spektakulære skrider i de sidste år 1. Vores forståelse af RNA potentiale i kontrol af genekspression er brast ved identifikation af kraftige kodende ribo- regulatorer 2, ved opdagelsen af nye RNA-baserede reguleringsmekanismer 3,4 og en dybere karakterisering af allerede kendte posttranskriptionel begivenheder 5. Alle sammen disse undersøgelser har tilladt RNA biologi til dramatisk gøre scenen, bliver et større forskningsprojekt emne i den aktuelle videnskabelige landskab. Især vi i de seneste år får en fornemmelse af den omsiggribende virkninger af "RNA-verden" på molekylær neurobiologi 6, en af de mest dynamiske forskningsområder i det moderne liv videnskab. I det sidste årti af det sidste århundrede, har den overordnede videnskabelige scenarie blevet revolutioneret af opdagelsen af RNA-interferens 7,8 og af de små regulatoriske RNA 9,10navnlig med hensyn til microRNA 11, endogent udtrykte små ikke-kodende RNA impliceret i kontrollen af næsten alle cellulære funktioner som pleiotropiske og kombinatoriske regulatorer af genekspression.

Næsten 10 år efter, at miRNA første opdagelse i Caenorhabditis elegans fra Ambros og Ruvkun labs blev fornyet opmærksomhed vendt til det område, hvor der blev konstateret høje antal af miRNA i Drosophila og i humane celler samt 12-15. Siden da, takket være alsidige transgene metoder har Drosophila melanogaster stod ud som en værdifuld biologisk kontekst for at dykke ned i miRNA biosyntese og aktivitet. Drosophila miRNA har afsløret særskilte funktioner i insekt-specifikke eller evolutionært bevarede processer, der spænder fra aldring til metabolisme, signalveje , adfærd og, selvfølgelig, neurogenese. Langs denne retning, vi for nylig afsløret en hidtil ukendt forbindelse 16 i spændende samarbejderrelation sted mellem master-genet GCM / glide og RNA-vejen. Fluen transskription faktor GCM / Glide 17-19 udgør et enestående eksempel på celle skæbne determinant, som dikterer glial- vs neuronale valg i multipotent flyve neurale forstadier 20. Tyve år lange forskning om dette emne har klart understreget forekomsten af flere og overlappende input af genekspression regulering konvergerende løbet GCM / glide 21-28 at fastslå tærskelværdier, der er nødvendige for at balancere den delikate forhold mellem neuronale og gliale kolleger i løbet af neurale udvikling.

Vi opdagede, at regulering via DMEL-miR279 målretning er en yderligere kontrol, som bidrager til posttranskriptionel finjustering af GCM / glide udtryk 16. Globalt har disse forsknings-linier, der kræves specifikke metodologiske forbedringer: langs år, adskillige teknologier oprindeligt udviklet til at analysere tradtionelle RNA'er er blevet konverteret til kvantificering af små ikke-kodende RNA, ligesom da RNase-beskyttelse assays, cDNA arrays 29-31, real-time PCR-metoder 32-35 og sekvensering 36,37. På den anden side, er kalibrering af tekniske metoder fremmes kontinuerlige skrider på området.

Northern blot assay (NB eller RNA-gel blot assay), udgør et repræsentativt eksempel: Det er i høj grad anvendes til at profilere RNA-ophobning, da det sikrer både udtryk niveau kvantificering samt størrelse beslutsomhed. Imidlertid er den iboende ringe sensitivitet af fremgangsmåden begrænsende, når det skal anvendes til lav-rigelige genekspression fine tunere, ligesom korte RNA'er. En skadelig konsekvens er kravet om store mængder af total RNA, som gør det vanskeligt dens anvendelse i specifikke biologiske prøver. Af disse grunde, specifikke NB varianter for små RNA detektion er blevet udviklet 38-40: vi tog fordel af en forbedret NB procedure 41 (ENB, Enhanced Northern blot), mens belyse ovennævnte samspil mellem DMEL-miR279 og GCM / glid.

Denne metode er baseret på en kemisk tværbindingstrinnet baseret på aktiviteten af ​​et carbodiimid derivat [1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimid EDC] for at fastsætte nucleinsyre på faste bærere. Carbodiimid er en alsidig tværbinder kendt for at katalysere dannelsen af amidbindinger mellem aktiverede carboxylgrupper eller phosphatgrupper og amingrupper 42. Denne egenskab kan udnyttes til kovalent par små RNA via deres mono-phosphorylerede 5'-hydroxylgruppen til aminogrupper ved overfladen af ​​nylonmembraner. Den resulterende fastgørelse konfiguration forøger tilgængeligheden af den immobiliserede nukleinsyre og igen effektiviteten af probe-mål-hybridisering, hvilket resulterer i en bemærkelsesværdig forøgelse detektion 43.

Teknikken er særlig relevance i Drosophila molekylære undersøgelser, hvorved forekomsten af nye og særprægede klasser af små ikke-kodende RNA er på vej 44. Blandt disse rasiRNAs 45,46 udgør en særlig undertype af piwi-interagerende RNA'er (piRNAs 47), der er involveret i sekvens-specifik gendæmpning. Operative detaljer om denne metode er fuldt beskrevet og visualiseret i det følgende, i forhold til analysen af microRNA'er DMEL-miR279 og DMEL-miR286 og for første gang, på en rasiRNA, rasi4. Vi pressede til ekstremer denne metode, hvilket tillod os at afsløre dårligt udtrykt mål fra minimale mængder af RNA (mindre end 1 ug).

Protocol

1. Prøvetagning Frigør semi-klæbende Schneiders 2 celler, (1-5 x 10 6 celler i gennemsnit), ved pipettering og høste dem ved centrifugering (100 xg i 1 minut). I tilfælde af in vitro dyrkede adhærente celler, Trypsinisér dem standardbetingelser eller direkte indsamle dem fra pladerne i en hensigtsmæssig mængde af RNA-ekstraktion reagens ved hjælp af en celleskraber. For embryonindsamling vokse Drosophila-stammer i flyve bure og lade embryoner samle sig på æg …

Representative Results

Ved at følge den generelle fremgangsmåde beskrevet i teksten og skematisk i figur 1, vurderede vi små RNA ekspression fra komplekse RNA-prøver fra forskellige oprindelser. I eksperimentet vist i figur 1, blev RNA isoleret fra Drosophila Schneiders 2 celler ved proteinase K udvinding, kontrolleres for integritet (valgfrit trin: denaturerende agarosegel fraktionering) og lagt i dobbelt. Den ene halvdel af gelen blev blottet på en neutral membran og kemisk tværbundet EDC; de…

Discussion

Selvom vores påskønnelse af sofistikeret sammenflettede hvorigennem RNA regulerer neurogenese er konstant stigende de mekanistiske konsekvenser af RNA-baserede kredsløbssystemer påvirker neurale stamceller biologi, neuronal differentiering / funktionel integration, udvikling af neurale patologier og kræftsygdomme forbliver uudforsket. Opretholdelsen af sådanne net gennem riger gør potentiale genetiske systemer Drosophila melanogaster medvirkende til at udrede uudforskede celleveje, hvor kort-kodende RNA …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dette arbejde blev støttet af Institut National de la santé et de la Recherche Médicale, Centre National de la Recherche Scientifique, Université de Strasbourg Hôpital de Strasbourg, Sammenslutningen pour la Recherche sur le Kræft, Institut National du Cancer, Agence Nationale de la Recherche og regionen Alsace.

Pietro LaNeve er blevet støttet af Fondation pour la Recherche Médicale. I øjeblikket er han en modtager af en Istituto Italiano Tecnologia (IIT) fællesskab. Publikationer understøttes af Neurex netværket (TriNeuron – Program Interreg IV Rhin)

Materials

FINAL COMPOSITION/NAME COMPANY CATALOGUE (Stock) COMMENTS
GENERAL REQUIREMENT
Centrifuge, 5418 Eppendorf 5418 000.017
Decontaminant, RNase Away Sigma-Aldrich 83931 Apply on glass/plasticware, wipe and rinse
RNase inhibitor, DEPC Sigma-Aldrich D5758 Hazardous //// 1609-47-8
0.1 % DEPC suspension Incubate 2 hr at 37 ˚C, then sterilize by autoclave
SAMPLE PREPARATION
Stereo Microscope, M60 Leica 
1X PBS Buffer
137 mM NaCl Sigma-Aldrich S3014 7647-14-5  
2.7 mM KCl Sigma-Aldrich P9541 7447-40-7 
10 mM Na2HPO4 Sigma-Aldrich S3264 7558-79-4 
1.8 mM KH2PO4 Sigma-Aldrich P9791 7778-77-0 
RNA EXTRACTION/ANALYSIS
UV-Vis Spectrophotometer Thermo Scientific Nanodrop 2000
Gel Imager, ChemiDoc XRS+ Biorad 170-8265
Horizontal Electrophoresys, Mini-Sub Cell GT BioRad 170-4487EDU
RNA extraction reagent, TRIzol Reagent Life Technologies 15596026 Hazardous
PCA (25:24:1), 1:1 for extraction Sigma-Aldrich 77617 136112-00-0
Chlorophorm, 1:1 for extraction Sigma-Aldrich C2432 67-66-3  
EtOH, 2.5 vol. for precipitation, 70% for washing Sigma-Aldrich 59844 64-17-5 
Gene Ruler 1Kb DNA Ladder Thermo Scientific SM0311
Stop Mix
300 mM NaOAc, pH 5.5 Sigma-Aldrich S2889 127-09-3
1x RSB Solution
2% sodium dodecyl sulfate (SDS) Sigma-Aldrich 71736 Never cool down SDS to avoid  precipitation //// 151-21-3
2 mg/ml Proteinase K Roche Applied Science 0-3115828001 EC 3.4.21.64 9
10X Reticulocyte Standard Buffer (RSB)
100 mM Tris-Cl, pH 7.4 Sigma-Aldrich T5941 1185-53-1  
100 mM NaCl Sigma-Aldrich S3014 7647-14-5  
30 mM MgCl2 Sigma-Aldrich M8266 7786-30-3
Denaturing Agarose Gel
1.2% Agarose Sigma-Aldrich A9539 Let the gel solidify for at least 1 hr //// 9012-36-2
1x MOPS Buffer Add when T < 60 ˚C
3% formaldehayde Sigma-Aldrich F8775 Hazardous. Add when T < 60 ˚C //// 50-00-0
10X MOPS Buffer
0.2 M MOPS sodium salt, pH 7 Sigma-Aldrich M9381 Do not confuse MOPS sodium salt with MOPS //// 71119-22-7
Agarose Loading Dye
1x MOPS Buffer
3% formaldehyde Sigma-Aldrich F8775 Hazardous //// 50-00-0
50% formamide Sigma-Aldrich 47670 Hazardous //// 75-12-7
Ethidium bromide (EtBr) 30 μg/ml Sigma-Aldrich E1510 Hazardous //// 1239-45-8
Bromophenol blue  Sigma-Aldrich B0126 115-39-9 
SMALL RNA FRACTIONATION
Flat gel loading tips Life Technologies LC1002
Savant SpeedVac Concentrator Thermo Scientific  DNA120
Vertical Electrophoresis, Mini-PROTEAN Tetra Cell  Biorad 165-8000
Denaturing Acrilamide Gel
10% acrylamide/bis-acrylamide (19:1) Sigma-Aldrich A3449 Hazardous. Let the gel polymerizefor 45 min before use
1x TBE Buffer (or 1x MOPS Buffer)
7 M urea Sigma-Aldrich U6504 57-13-6
0.1% ammonium persulfate Sigma-Aldrich 215589 7727-54-0 
0.1% TEMED Sigma-Aldrich T9281 110-18-9
Gene Ruler Ultra Low Range DNA Ladder (10 bp-step) Thermo Scientific SM1211 Label 0.1 μg, as described in the "probe labeling" reaction
Acrylamide Blue Dye 
50% formamide Sigma-Aldrich 47670 Hazardous //// 75-12-7
Bromophenol blue Sigma-Aldrich B0126 115-39-9 
Running Buffer (RB)
1x MOPS Buffer 
Alternative RB: 1x TBE Buffer
1x TBE Buffer
5X TBE
445 mM Tris-base Sigma-Aldrich T1503 77-86-1 
445 mM boric acid Sigma-Aldrich B7901 10043-35-3
20 mM EDTA Sigma-Aldrich EDS 60-00-4  
Gel Staining Solution
Ethidium bromide 0.5 μg/ml Sigma-Aldrich E1510 Hazardous //// 1239-45-8
1x RB Stain for 15 min with EtBr, destain for 15 min w/o EtBr
BLOTTING
3MM Whatman paper Sigma-Aldrich Z270849
Neutral Nylon Membrane, Hybond NX GE Healthcare Life Science RPN203T Photosensitive
CROSSLINKING
Crosslinking Solution (XLS)
1% 1-methylimidazole (v/v) Sigma-Aldrich 336092 Always prepare a fresh aliquot of XLS //// 616-47-7
12.5 mM HCl Sigma-Aldrich H1758 Hazardous //// 7647-01-0
3.1% EDC (w/v) Sigma-Aldrich 3450 25952-53-8  
(PRE)-HYBRIDIZATION
Liquid Scintillation Counter  Beckmann LS 6500
Sheared Salmon Sperm, 0.1 mg/ml  Life Technologies AM9680
rasi4 antisense probe 5' CGGUGUUCGACAGUUCCUCGGG -3'
5s-rRNA antisense probe 5'-CAACACGCGGTGTTCCCAAGCCG-3'
Dmel-miR279 antisense probe 5'-TTAATGAGTGTGGATCTAGTCA-3'
Dmel-miR286 antisense probe 5'-AGCACGAGTGTTCGGTCTAGTCA-3'
Purification Kit, Illustra MicroSpin G-25 Columns GE Healthcare Life Science 27-5325-01
(Pre)-Hybridization Solution (HS)
6x SSPE Pre-warm HS at 37 ˚C before use
0.5% SDS Sigma-Aldrich 71736 151-21-3 
5x Denhardt's Solution
20X SSPE
3.6 M NaCl Sigma-Aldrich S3014 7647-14-5  
0.2 M sodium phosphate Sigma-Aldrich 342483 7601-54-9  
20 mM EDTA (pH 8.0) Sigma-Aldrich EDS  60-00-4  
50x Denhardt's Solution
1% Ficoll 400 (w/v) Sigma-Aldrich F2637 26873-85-8
1% Polyvinylpyrrolidone Sigma-Aldrich PVP40 9003-39-8
1% BSA Sigma-Aldrich A7906 9048-46-8  
1X TEN Buffer
10 mM Tris-Cl (pH 8.0) Sigma-Aldrich T1503 77-86-1 
100 mM NaCl Sigma-Aldrich S3014 7647-14-5  
1 mM EDTA (pH 8.0) Sigma-Aldrich EDS  60-00-4  
Probe Labelling
0.4 μM oligonucleotide
1.5 μl Ci/μl [γ-32P] ATP Perkin Elmer NEG002A Hazardous //// 51963-61-2
1x T4 Polynucleotide Kinase Buffer Biolabs B0201
T4 Polynucleotide Kinase 0.5 units/μl Biolabs M0201 EC 2.7.1.78
30 min at 37 ˚C, stop by 20 mM EDTA
WASHING
Geiger Mueller Detectors Canberra Industries MCB2/CPS – EM77021
Washing Buffer (WB), 2x SSPE
Stringent Washing Buffers
0.2x SSPE
2x SSPE, 0.5% SDS
0.2x SSPE, 0.5% SDS
SIGNAL DETECTION
PharosFX Plus System Biorad 170-9460
Image J Freely available
Quantity One Biorad
X-ray films , BioMax XAR Sigma-Aldrich F5888 Photosensitive
Developer for X-ray films Sigma-Aldrich P7042
Fixer for X-ray films Sigma-Aldrich P7167
STRIPPING
Stripping Solution
10 mM Tris-HCl pH 8.8 Sigma-Aldrich T1503 77-86-1 
5 mM EDTA Sigma-Aldrich EDS  60-00-4  
0.1% SDS Sigma-Aldrich 71736 Add SDS after boiling to avoid foaming //// 151-21-3
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gesteland, R. F., Cech, T. R., Atkins, J. F. . The RNA World. , (2006).
  2. Mercer, T. R., Dinger, M. E., Mattick, J. S. Long non-coding RNAs: insights into functions. Nat Rev Genet. 10, 155-159 (2009).
  3. Salmena, L., Poliseno, L., Tay, Y., Kats, L., Pandolfi, P. P. A ceRNA hypothesis: the Rosetta Stone of a hidden RNA language?. Cell. 146, 353-358 (2011).
  4. Cesana, M., et al. A long noncoding RNA controls muscle differentiation by functioning as a competing endogenous RNA. Cell. 147, 358-369 (2011).
  5. Orphanides, G., Reinberg, D. A unified theory of gene expression. Cell. 108, 439-451 (2002).
  6. Mehler, M. F., Mattick, J. S. Noncoding RNAs and RNA editing in brain development, functional diversification, and neurological disease. Physiol Rev. 87, 799-823 (2007).
  7. Fire, A., Xu, S., Montgomery, M., Kostas, S., Driver, S., Mello, C. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391, 806-811 (1998).
  8. Hamilton, A., Baulcombe, D. A species of small antisense RNA in posttranscriptional gene silencing in plants. Science. 286, 950-952 (1999).
  9. Lee, R. C., Feinbaum, R. L., Ambros, V. The C. Elegans heterochronic gene lin-4 encodes small RNAs with antisense complementarity to lin-14. Cell. 75, (1993).
  10. Wightman, B., Ha, I., Ruvkun, G. Posttranscriptional regulation of the heterochronic gene lin-14 by lin-4 mediates temporal pattern formation in C. elegans. Cell. 75, 855-862 (1993).
  11. Fabian, M. R., Sonenberg, N., Filipowicz, W. Regulation of mRNA translation and stability by microRNAs. Annu Rev Biochem. 79, 351-379 (2010).
  12. Pasquinelli, A. E., et al. Conservation of the sequence and temporal expression of let-7 heterochronic regulatory RNA. Nature. 408, 86-89 (2000).
  13. Lagos-Quintana, M., Rauhut, R., Lendeckel, W., Tuschl, T. Identification of novel genes coding for small expressed RNAs. Science. 294, 853-858 (2001).
  14. Lau, N. C., Lim, L. P., Weinstein, E. G., Bartel, D. P. An abundant class of tiny RNAs with probable regulatory roles in Caenorhabditis elegans. Science. 294, 858-862 (2001).
  15. Lee, R. C., Ambros, V. An extensive class of small RNAs in Caenorhabditis elegans. Science. 294, 862-864 (2001).
  16. Laneve, P., et al. The Gcm/Glide molecular and cellular pathway: new actors and new lineages. Dev Biol. 375, 65-78 (2013).
  17. Hosoya, T., Takizawa, K., Nitta, K., Hotta, Y. Glial cells missing: a binary switch between neuronal and glial determination in Drosophila. Cell. 82, 1025-1036 (1995).
  18. Jones, B. W., Fetter, R. D., Tear, G., Goodman, C. S. Glial cells missing: a genetic switch that controls glial versus neuronal fate. Cell. 82, 1013-1023 (1995).
  19. Vincent, S., Vonesch, J. L., Giangrande, A. Glide directs glial fate commitment and cell fate switch between neurons and glia. Developement. 122, 131-139 (1996).
  20. Cattenoz, P. B., Giangrande, A. Lineage specification in the fly nervous system and evolutionary implications. Cell Cycle. 12, 2753-2759 (2013).
  21. Jones, B. W., Abeysekera, M., Galinska, J., Jolicoeur, E. M. Transcriptional control of glial and blood cell development in Drosophila: cis-regulatory elements of glial cells missing. Dev Biol. 266, 374-387 (2004).
  22. Ragone, G., et al. Transcriptional regulation of glial cell specification. Dev Biol. 255, 138-150 (2003).
  23. Akiyama-Oda, Y., Hosoya, T., Hotta, Y. Asymmetric cell division of thoracic neuroblast 6-4 to bifurcate glial and neuronal lineage in Drosophila. Development. 126, 1967-1974 (1999).
  24. Bernardoni, R., Kammerer, M., Vonesch, J. L., Giangrande, A. Gliogenesis depends on glide/gcm through asymmetric division of neuroglioblasts. Dev Biol. 216, 265-275 (1999).
  25. Ragone, G., Bernardoni, R., Giangrande, A. A novel mode of asymmetric division identifies the fly neuroglioblast 6-4T. Dev Biol. 235, 74-85 (2001).
  26. Soustelle, L., Roy, N., Ragone, G., Giangrande, A. Control of gcm RNA stability is necessary for proper glial cell fate acquisition. Mol Cell Neurosci. 37, 657-662 (2008).
  27. Akiyama, Y., Hosoya, T., Poole, A. M., Hotta, Y. The gcm-motif: a novel DNA-binding motif conserved in Drosophila and mammals. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 25, 14912-14916 (1996).
  28. Miller, A. A., Bernardoni, R., Giangrande, A. Positive autoregulation of the glial promoting factor glide/gcm. EMBO J. 17, 6316-6326 (1998).
  29. Krichevsky, A. M., King, K. S., Donahue, C. P., Khrapko, K., Kosik, K. S. A microRNA array reveals extensive regulation of microRNAs during brain development. RNA. 9, 1274-1281 (2003).
  30. Liu, C. G., et al. An oligonucleotide microchip for genome-wide microRNA profiling in human and mouse tissues. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 101, 9740-9744 (2004).
  31. Yin, J. Q., Zhao, R. C., Morris, K. V. Profiling microRNA expression with microarrays. Trends Biotechnol. 26, 70-76 (2008).
  32. Schmittgen, T. D., Jiang, J., Liu, Q., Yang, L. A high-throughput method to monitor the expression of microRNA precursors. Nucleic Acids Res. 32, E43 (2004).
  33. Chen, C., et al. Real-time quantification of microRNAs by stem-loop RT-PCR. Nucleic Acids Res. 33, e179 (2005).
  34. Shi, R., Chiang, V. L. Facile means for quantifying microRNA expression by real-time PCR. Biotechniques. 39, 519-525 (2005).
  35. Raymond, C. K., Roberts, B. S., Garrett-Engele, P., Lim, L. P., Johnson, J. M. Simple quantitative primer-extension PCR assay for direct monitoring of microRNAs and short-interfering RNAs. RNA. 11, 1737-1744 (2005).
  36. Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nat Rev Genet. 10, 57-63 (2009).
  37. Linsen, S. E., et al. Limitations and possibilities of small RNA digital gene expression profiling. Nat Methods. 6, 474-476 (2009).
  38. Valoczi, A., et al. Sensitive and specific detection of microRNAs by northern blot analysis using LNA-modified oligonucleotide probes. Nucleic Acids Res. 32, e175 (2004).
  39. Varallyay, E., Burgyan, J., Havelda, Z. Detection of microRNAs by Northern blot analyses using LNA probes. Methods. 43, 140-145 (2007).
  40. Kim, S. W., et al. A sensitive non-radioactive northern blot method to detect small RNAs. Nucleic Acids Res. 38, e98 (2010).
  41. Pall, G. S., Hamilton, A. J. Improved northern blot method for enhanced detection of small RNA. Nat Protoc. 3, 1077-1084 (2008).
  42. Hermanson, G. T. . Bioconjugate Techniques. , (2008).
  43. Pall, G. S., Codony-Servat, C., Byrne, J., Ritchie, L., Hamilton, A. Carbodiimide-mediated cross-linking of RNA to nylon membranes improves the detection of siRNA, miRNA and piRNA by northern blot. Nucleic Acids Res. 35, e60 (2007).
  44. Guzzardo, P. M., Muerdter, F., Hannon, G. J. The piRNA pathway in flies: highlights and future directions. Curr Opin Genet Dev. 23, 44-52 (2013).
  45. Aravin, A. A., et al. Double-stranded RNA-mediated silencing of genomic tandem repeats and transposable elements in the D. melanogaster germline. Curr. Biol. 11, 1017-1027 (2001).
  46. Vagin, V. V., et al. A distinct small RNA pathway silences selfish genetic elements in the germline. Science. 313, 320-324 (2006).
  47. Brennecke, J., et al. Discrete small RNA-generating loci as master regulators of transposon activity in Drosophila. Cell. 128, 1089-1103 (2007).
  48. Sullivan, W., Ashburner, M., Hawley, R. S. . Drosophila protocols. , (2008).
  49. Zamore, P. D., Ma, S. Isolation of Drosophila melanogaster testes. J. Vis. Exp. (51), e2641 (2011).
  50. Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. . Molecular cloning : a laboratory manual. , (1989).
  51. Alwine, J. C., Kemp, D. J., Stark, G. R. Method for detection of specific RNAs in agarose gels by transfer to diazobenzyloxymethyl-paper and hybridisation with DNA probes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 74, 5350-5354 (1977).
  52. Hansen, T. B., et al. Natural RNA circles function as efficient microRNA sponges. Nature. 495, 384-388 (2013).
  53. Flores-Jasso, C. F., Salomon, W. E., Zamore, P. D. Rapid and specific purification of Argonaute-small RNA complexes from crude cell lysates. RNA. 19, 271-279 (2013).
  54. Specchia, V., et al. Hsp90 prevents phenotypic variation by suppressing the mutagenic activity of transposons. Nature. 463, 662-665 (2010).
  55. Várallyay, E., Burgyán, J., Havelda, Z. MicroRNA detection by northern blotting using locked nucleic acid probes. Nat Protoc. 3, 190-196 (2008).
  56. Koscianska, E., Starega-Roslan, J., Czubala, K., Krzyzosiak, W. J. High-resolution northern blot for a reliable analysis of microRNAs and their precursors. ScientificWorldJournal. 11, 102-117 (2011).

Tags

Keywords: Enhanced Northern BlotSmall RNAMicroRNADrosophila MelanogasterGene ExpressionPost-transcriptional RegulationNoncoding RNARNA ProfilingRNA DetectionMolecular BiologyEmbryoCell Culture
check_url/kr/51814?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Laneve, P., Giangrande, A. Enhanced Northern Blot Detection of Small RNA Species in Drosophila Melanogaster. J. Vis. Exp. (90), e51814, doi:10.3791/51814 (2014).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image