المتعدد الوسائط البصرية الميكروسكوب طرق كشف ورم الأنسجة الصرف والبنية في منطقة البحر الكاريبي المرجانية بناء المرجان
Summary
وقد تم تطبيق مجموعة متكاملة من تقنيات التصوير لتحديد مورفولوجيا سليلة وهيكل الأنسجة في الشعاب المرجانية بالبحر الكاريبي Montastraea الحلقي وم. faveolata. مضان، التسلسلي وجه كتلة، واثنين من الفوتون الليزر متحد البؤر المجهر وقد حدد هيكل lobate، سليلة الجدران، وحامل الصباغ المقدرة وكثافة زوزانتلي والتوزيعات.
Abstract
وقد تم تطبيق مجموعة متكاملة من تقنيات التصوير لتحديد ثلاثي الأبعاد (3D) مورفولوجيا والهيكل الخلوي للأنسجة سليلة تضم الشعاب المرجانية بناء الشعاب المرجانية الكاريبي Montastraea الحلقي وم. faveolata. وتشمل هذه النهج المجهري مضان (FM)، وكتلة التسلسلي وجه التصوير (SBFI)، واثنين من الفوتون الليزر متحد البؤر المجهر (TPLSM). يوفر SBFI التصوير الأنسجة العميقة بعد باجتزاء المادي؛ أنها تبين بالتفصيل نسيج السطح الأنسجة والتصور 3D إلى أعماق الأنسجة أكثر من 2 ملم. FM التكميلي والعائد TPLSM الصور دقة عالية جدا عالية من الأنسجة بنية الخلية. وقد النتائج: (1) تحديد المبلغ عنه سابقا الأشكال التضاريسية الأنسجة lobate على الجدار الخارجي للالبوليبات المرجانية الفردية و(2) خلق الخرائط السطحية الأولى من توزيع كثافة 3D والأنسجة من chromatophores وendosymbionts دوامي السياط زوزانتلي تشبه الطحالب. البازلاء امتصاص الطيفيKS 500 نانومتر و 675 نانومتر، على التوالي، تشير إلى أن م. الحلقي وم. faveolata تحتوي على أنواع مماثلة من الكلوروفيل وchromatophores. ومع ذلك، M. الحلقي وم. faveolata تظهر اختلافات كبيرة في كثافة الأنسجة وتوزيع 3D من هذه المكونات الخلوية الأساسية. هذه الدراسة تركز على أساليب التصوير تشير إلى أن SBFI مفيد للغاية لتحليل عينات مم على نطاق كبير من الأنسجة المرجانية decalcified. FM مجانية وTPLSM خفية تكشف التغيرات الواسعة في التوزيع دون المليمتر الخلوي وكثافة في nondecalcified عينات الأنسجة المرجانية. هذه التقنية تتيح TPLSM: (1) مينيملي إعداد العينات، (2) متفوقة باجتزاء القدرة البصرية، و (3) الحد الأدنى من امتصاص الضوء وتشتت، في حين لا يزال يسمح التصوير الأنسجة العميقة.
Introduction
ظاهرة الاحتباس الحراري والتغير البيئي المصاحب تؤثر مباشرة على صحة وتوزيع الشعاب المرجانية البحرية الاستوائية 1-4. ويجري الاحتفال آثار متعددة، بما في ذلك تبييض المرجان وظهور الأمراض المعدية 5-6. ومع ذلك، فإن التنبؤ أكثر دقة للاستجابة المرجانية المستقبلية لهذه التهديدات البيئية تتطلب أن "الأساس" النسيجي أن تنشأ، والذي يحدد مورفولوجيا الأنسجة وتكوين خلايا وتوزيع الشعاب المرجانية "اصحاء". بدوره، "أثر" ويمكن بعد ذلك المرجان يمكن مقارنة كميا. وعلاوة على ذلك، ينبغي إنشاء خط الأساس لهذه الشعاب المرجانية يبدو صحية في إطار مجموعة من الظروف البيئية، حتى أن "استجابة صحية" كما يمكن قياسه عبر التدرجات البيئية. كخطوة أولى نحو إنشاء هذا الأساس، تم إجراء دراسة 3D عالية الدقة كيف يبدو المرجانية صحي الأنسجة سليلةالتشكل والتكوين الخلوي يستجيب إلى زيادات في عمق المياه (WD) وانخفاض المرفقة في ضوء الشمس الساقط. ويمكن بعد ذلك أن تستخدم النتائج للتوصل إلى فهم الآلية أشمل من التكيف المرجانية، وكذلك لاكتساب نظرة ثاقبة التطور-المرجانية المتكافل وتعزيز حصاد الضوء.
الشعاب المرجانية الحجرية (Scleractinia) هي الحيوانات اللافقارية البحرية الاستعمارية التي تلعب المضيفة لتجميع معقدة من الكائنات الحية الدقيقة الأخرى، يشار إليها مجتمعة ب holobiont المرجان 7-10. يسعى البحوث التي أجريت في هذه الدراسة إلى استخدام مجموعة من تقنيات التصوير المتطورة لتعقب التغييرات في وقت واحد مع تزايد عمق المياه في أصباغ الأنسجة وزوزانتلي التكافلية من الشعاب المرجانية المضيفة على ما يبدو صحية. هذا سوف إنشاء خلية الأنسجة المقارنة "خط الأساس" المطلوبة عبر التدرج الأعماق لالشعاب المرجانية يبدو صحية ويكون بمثابة مؤشرات التدفئة المرجانيةLTH 10. أصباغ المرجانية، ودعا chromatophores، تعمل على امتصاص، تعكس، مبعثر، ينكسر، حيد الضوء، أو التدخل خلاف مع الحادث الإشعاع الشمسي 11. وقد مكن العلاقة endosymbiotic-زوزانتلي حامل الصباغ في coevolution من المفيد استراتيجيا الأمثل حصاد الضوء واستراتيجيات النمو والهيكل العظمي، وكذلك اللدونة الغذائية (استراتيجيات التغذية التحول ذهابا وإيابا من ذاتية التغذي إلى اضطراب تغذوي) للحيوان المرجان 12.
الأمة جنوب البحر الكاريبي جزيرة كوراساو (سابقا جزء من جزر الأنتيل الهولندية) تقع حوالي 65 كم من شمال فنزويلا ضمن الغربي الشرقي تتجه أروبا، لا Blanquilla أرخبيل (الشكل 1A). الساحل الجنوبي 70 كم كوراساو يحتوي على الحديث المستمر والميوسين، العصر الحديث، العصر الجليدي-الهولوسين القديم التهديب الشعاب المرجانية المسالك 13،14. يعني SST السنوي في كوراساو تختلف حوالي 3 ° C لnually، بدءا من حد أدنى من 26 درجة مئوية في أواخر يناير كانون الثاني لمدة أقصاها 29 درجة مئوية في أوائل سبتمبر، مع متوسط درجة الحرارة السنوي 27.5 ± 0.5 درجة مئوية (NOAA SST سجلات، 2000-2010). الشعاب المرجانية في بلايا كالكي (12 ° 22'31.63 "N، 69 ° 09'29.62" W)، والكذب بالقرب من الطرف الشمالي الغربي من جزر الأنتيل (الشكل 1A)، وقد تم اختيار لأخذ العينات لأنها كانت سابقا المدروس جيدا و واستحم النظام البيئي البحري في هذا الموقع في مياه البحر الطازجة 7،15-19 nonpolluted. اثنان وثيقة الصلة الأنواع المرجانية scleractinian، M. الحلقي وM faveolata، تم اختيار للتجريب والتحليل في هذه الدراسة لأن كل الأنواع: (1) معارض مختلفة بوضوح وغير المتداخلة توزيعات الأعماق على الجهاز الشعاب فيما يتعلق كسر الرف و يرتبط الرسوبية كربونات بيئات الترسيب (م. مجموعة الحلقي = 0-10 م WD، M. faveolataمجموعة = 10-20 م WD 20؛ أرقام 1B، 2A، 2B و). (2) هو إطار الشعاب المرجانية المشترك البناء في جميع أنحاء البحر الكاريبي 21؛ و (3) لديها مدروسة البيئية والفسيولوجية، والعلاقات التطورية 22.
أجري أخذ العينات الميدانية لهذه الدراسة باستخدام تقنيات الغوص القياسية في الخارج من بلايا كالكي في كوراساو. وأنشئ الضحلة إلى المياه العميقة قياس الأعماق المسح الشامل الذي ركض عبر الرف، خلال عطلة الرف، وإلى بيئات الشعاب الصدارة في المياه العميقة. على ما يبدو ثم تم تحديد رؤساء المرجانية صحي لأخذ العينات على طول هذه القطع الأعماق، بما في ذلك: (1) ثلاث فرد ~ 1 م رؤساء قطرها المرجانية من M. الحلقي، وكلها كانت في 5 متر عمق المياه (WD). و (2) ثلاثة الفرد ~ 1 م رؤساء قطرها المرجانية من M. faveolata، وكلها كانت في 12 م WD. وتم قياس التمثيل الضوئي الإشعاع النشط (PAR) كما 33-36٪ P AR في 5 م WD و18-22٪ PAR في 10 م WD. أجري أخذ العينات في يناير كانون الثاني عندما كانت طائرة أسرع من الصوت 26 درجة مئوية في أعماق المياه على حد سواء 5 م و 12 م. وأخذت عينات كل من هذه الرؤوس المرجانية ستة في ثلاث نسخ على مواقع المكانية أي ما يعادل (أي ما يقارب 45 ° N خط العرض على كل من ستة رؤساء المرجانية نصف كروية). وتألفت كل عينة الفردية ل2.5 سم القطر الشعاب الهيكل العظمي الأنسجة الخزعة الأساسية التي تم جمعها مع لكمة قوس تنظيفها. أخذت عينات الخزعات ثلاثة الأنسجة الهيكل العظمي المرجانية على الغوص قياسي بأيد القفاز من كل من رؤساء المرجانية (9 من م. حلقية المستعمرات في 5 م WD و 9 من faveolata م في 12 م WD). فور جمع في العمق، وضعت كل عينة خزعة الأساسية في العقيمة 50 مل أنبوب البولي بروبلين الطرد المركزي، المسمار أعلى مختومة، وعاد إلى السطح. ويصب في مياه البحر من كل أنبوب الطرد المركزي ثم تم مغمورة كل خزعة الأساسية وتخزينها ونقلها في بارافورمالدهيد 4٪.
<p class="jove_content"> وقد سبق إجراء التصوير SBFI على مجموعة واسعة من العينات البيولوجية، بما في ذلك كامل الدماغ والأنسجة البشرية كله القلب، أجنة فئران سليمة، وأجنة سمك الزرد، وأنواع متعددة من عينات الحيوانات مع عظام سليمة 23-30. معظم هذه الدراسات تستخدم البصرية / المجهر الضوئي مع أي مضان أو تقنيات الحقل مشرق. ومع ذلك، فقد أجريت دراسات في تكبير عالية جدا باستخدام المسح الإلكترون كتلة التسلسلي التصوير وجه في 31 الماضي. في هذه الدراسة، تم وضع بروتوكول لتعديل SBFI وتطبيقها على الشعب المرجانية لأول مرة. لأن M. الحلقي وم. البوليبات المرجانية faveolata هي 1-2 مم في السمك، فإن أيا من تقنيات الفحص المجهري الخفيفة الروتينية تكون قادرة على اختراق سماكة كامل من الأنسجة سليلة المرجانية. بالتالي، لدينا SBFI بروتوكول إعداد العينات التي صممت خصيصا لعينات المرجانية. بالإضافة إلى ذلك، قمنا بتصميم مخصص حامل stereomicroscopeالذي بمحركات التحرك في كلا الاتجاهين x و ذ. هذا الجهاز يأخذ الصور من الوجه كتلة من العينة بدلا من جمع الأقسام باستخدام مشراح منتظم أمام المجهر. قدمنا أيضا تقنية أخرى غير الخطية البصرية ثنائي الفوتون المجهري لصورة نفس الشعاب المرجانية في جميع أنحاء سمك كامل من الأنسجة المرجانية. هذا يتغلب على القيود التي تفرضها SBFI من حيث زوال الكلس وإمكانية حدوث تغيرات في مورفولوجيا الأنسجة وحجم (تقلص) التي قد يسببها إعداد العينات (الجفاف) وبروتوكولات المعالجة. وعلاوة على ذلك، تم حل لمحات الانبعاثات من الشعاب المرجانية طيفيا لتحديد الانبعاثات ذروتها والاختلافات بين chromatophores وزوزانتلي الضوئي. تم تقييم هذه النتائج في سياق الطريقة المستخدمة والمزايا الفردية بشأن اكتساب الوقت، وقت التحليل، والقدرة على حل التفاصيل الهيكلية غرامة دون المساس شارعسلامة uctural من الأنسجة المرجانية.Protocol
Representative Results
Discussion
البحث الشعاب المرجانية هو جهد بحثي متعدد التخصصات للغاية، تنطوي على تحليل متزامنة الفيزيائية والكيميائية، والظواهر البيولوجية التي تعمل في البيئة البحرية. لذا أفضل اكتمال دراسة النظم الإيكولوجية للشعاب المرجانية المعقدة داخل "القوى العشرة" إطار السياقية <stron…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Donna Epps, histologist at Institute for Genomic Biology, University of Illinois Urbana-Champaign (UIUC), for her capable technical assistance in sample preparation and sectioning. This work was supported by a research grant to B.W. Fouke from the Office of Naval Research (N00014-00-1-0609). In addition, C.A.H. Miller received grants from the UIUC Department of Geology Wanless Fellowship, UIUC Department of Geology Leighton fund and UIUC Department of Geology Roscoe Jackson fieldwork fund. Interpretations presented in this manuscript are those of the authors and may not necessarily represent those of the granting institutions. We also thank the Caribbean Research and Management of Biodiversity (Carmabi) laboratory on Curaçao for their support and collaboration in collecting the coral tissue biopsy samples. We thank Claudia Lutz, IGB Media Communication Specialist for her able language correction.
Materials
| Coral Tissue Skeleton | None | None | 2.5 cm Biopsy from natural habitat |
| Arch Punch Coring Device | C.S. Osborne and Company | No. 149 | For Coral biopsy collection |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | RT 15700 | 16% Pre-diluted |
| Histoclear/Safeclear II | Electron Microscopy Sciences | RT 64111-04 | Non-Toxic alternate to Xylene, Dehydration and Deparafinization |
| Xylene and Ethanol | Fisher Scientific | Fisher Scientific | Dehydration |
| Paraffin Wax | Richard Allen Scientific | Type H REF 8338 | Infiltration solution |
| Vybar | The Candle Maker | None | Component of Red Wax |
| Stearin | The Candle Maker | None | Component of Red Wax |
| Sudan IV | Fisher Chemical | S667-25 | Red Wax-Opaque background |
| Wheat Germ Agglutinin (WGA) | Life Technologies | W32466 | For labeling Coral Mucus |
| Prolong Gold | Life Technologies | P36095 | Anti-fade mounting media |
| Fluoro Dish | World Precision Instruments | FD-35-100 | For two-photon imaging |
| XY Motor, Driver and Controller | Lin Engineering | 211-13-01R0, R325, R256-RO | XY Translational Movement |
| Hot Plate | Corning | DC-220 | Melting all wax |
| Convection Oven | Yamato | DX-600 | Infiltration and Embedding |
| Tissue Processor | Leica | ASP 300 | Dehydration, Infiltration |
| Microtome | Leica | RM2055 | Disposable knifes |
| Stereo Microscope | Carl Zeiss | Stereolumar V 12 | 1.5x (30 mm WD) Objective |
| Fluorescence Microscope with ApoTome | Carl Zeiss | Axiovert M 200, ApoTome I System | Imaging thin section of a polyp: Zooxanthellae |
| Axiocam camera | Carl Zeiss | MRm | Monochrome camera 1388×1040 pixels |
| Axiovision Software | Carl Zeiss | Version 4.8 | Image acquisition program |
| Two-Photon Laser | Spectraphysics | Maitai eHP, pulsed laser (70 fs) | With DeepSee module |
| Laser Scanning Microscope | Carl Zeiss | LSM 710 with Spectral Detector | 34 channel PMT detection |
| Zen Software | Carl Zeiss | 2010 or above | for two-photon and spectral image acquisition |
| Imaris Suite Software | Bitplane, Inc., | Version 7.0 or above | 3D Volume, Iso-surface Rendering, Visualization |
References
- Stocker, T. F., Qin, D., Plattner, G. -. K., Tignor, M., Allen, S. K., Boschung, J., Nauels, A., Xia, Y., Bex, V., Midgley, P. M. . Climate Change 2013: The Physical Science Basis. Contribution of Working Group I to the Fifth Assessment Report of the Intergovernmental Panel on Climate Change. , 1535 (2013).
- Buddemeir, R. W., Kleypas, J. A., Aronson, R. B. . Coral Reefs & Global Climate Change: Potential Contributions of Climate Change to Stresses on Coral Reef Ecosystems). 46, (2004).
- Wilkinson, C. . Status of coral reefs of the world. , 1-2 (2004).
- Lough, J. M. Climate records from corals. WIREs Clim. Chang. 1, 318-331 (2010).
- Harvell, C. D., et al. Tropical Archaea: diversity associated with the surface microlayer of corals. Mar. Ecol. Prog. Ser. 273, 81-88 (2004).
- Rosenberg, E., Loya, Y. . Coral Health and Disease. , (2004).
- Rohwer, F., Breitbart, M., Jara, J., Azam, F., Knowlton, N. Diversity of bacteria associated with the Caribbean coral Montastrea franksi. Coral Reefs. 20, 85-91 (2001).
- Frias-Lopez, J., Zerkle, A. L., Bonheyo, G. T., Fouke, B. W. Partitioning of bacterial communities between seawater and healthy, black band diseased, and dead coral surfaces. Appl. Environ. Microbiol. 68, 2214-2228 (2002).
- Stanley, G. D. The evolution of modern corals and their early history. Earth Sci. Rev. 60, 195-225 (2003).
- Piggot, A. M., Fouke, B. W., Sivaguru, M., Sanford, R., Gaskins, H. R. Change in zooxanthellae and mucocyte tissue density as an adaptive response to environmental stress by the coral Montastraea annularis. Mar. Biol. 156, 2379-2389 (2009).
- Stanley, G. D. Photosymbiosis and the evolution of modern coral reefs. Evolution. 1, 3 (2006).
- Gordon, B. R., Leggat, W. Symbiodinium—Invertebrate Symbioses and the Role of Metabolomics. Mar. Drugs. 8, 2546-2568 (2010).
- Schlichter, D., Weber, W., Fricke, H. W. A chromatophore system in the hermatypic, deep-water coral Leptoseris fragilis (Anthozoa: Hexacorallia). Marine Biology. 89, 143-147 (1994).
- Fouke, B. W., Meyers, W. J., Hanson, G. N., Beets, C. J. Chronostratigraphy and dolomitization of the Seroe Domi Formation, Curacao, Netherlands Antilles. Facies. 35, 293-320 (1996).
- Frias-Lopez, J., Bonheyo, G. T., Jin, Q., Fouke, B. W. Cyanobacteria associated with coral black band disease in Caribbean and Indo-Pacific reefs. Appl. Environ. Microbiol. 69, 2409-2413 (2003).
- Frias-Lopez, J., Klaus, J., Bonheyo, G. T., Fouke, B. W. The bacterial community associated with black band disease in corals. Appl. Environ. Microbiol. 70, 5055-5062 (2004).
- Frias-Lopez, J., Bonheyo, G. T., Fouke, B. W. Identification of differential gene expression in bacteria associated with coral black band disease using RNA-arbitrarily primed PCR. Appl. Environ. Microbiol. 70, 3687-3694 (2004).
- Klaus, J. S., Frias-Lopez, J., Bonheyo, G. T., Heikoop, J. M., Fouke, B. W. Bacterial communities inhabiting the healthy tissues of two Caribbean reef corals: interspecific and spatial variation. Coral Reefs. 24, 129-137 (2005).
- Klaus, J., Janse, I., Sandford, R., Fouke, B. W. Coral microbial communities, zooxanthellae, and mucus along gradients of seawater depth and coastal pollution. Environ. Microbiol. 9, 1291-1305 (2007).
- van Duyl, F. C. . Atlas of the living reefs of Curacao and Bonaire (Netherlands Antilles). , (1985).
- Carricart-Ganivet, J. P. Sea surface temperature and the growth of the West Atlantic reef building coral Montastraea annularis. J. Exp. Mar. Biol. Ecol. 302, 249-260 (2004).
- Barnes, D. J., Lough, J. M. Coral skeletons: Storage and recovery of environmental information. Global Chang. Biol. 2, 569-582 (1996).
- Mohun, T. J., Weninger, W. J. Generation of volume data by episcopic three-dimensional imaging of embryos. Cold Spring Harbor Protocols. 6, 069591 (2012).
- Mohun, T. J., Weninger, W. J. Imaging heart development using high-resolution episcopic microscopy. Curr. Opin. Genet. Dev. 21, 573-578 (2011).
- Mohun, T. J., Weninger, W. J. Embedding embryos for episcopic fluorescence image capturing (EFIC). Cold Spring Harb. Protoc. 6, 069575 (2012).
- Rosenthal, J., et al. Rapid high resolution three dimensional reconstruction of embryos with episcopic fluorescence image capture. Birth Defects Res. C: Embryo Today: Rev. 72, 213-223 (2004).
- Slyfield, C. R., et al. Three-dimensional surface texture visualization of bone tissue through epifluorescence-based serial block face imaging. J. Microsc. 236, 52-59 (2009).
- Weninger, W., Mohun, T. Phenotyping transgenic embryos: a rapid 3-D screening method based on episcopic fluorescence image capturing. Nat. Genet. 30, 59-65 (2001).
- Weninger, W., Mohun, T. . Three-dimensional analysis of molecular signals with episcopic imaging techniques. Reporter Genes. , 35-46 (2007).
- Gerneke, D. A., et al. Surface imaging microscopy using an ultramiller for large volume 3D reconstruction of wax-and resin-embedded tissues. Microsc. Res. Tech. 70, 886-894 (2007).
- Denk, W., Horstmann, H. Serial block-face scanning electron microscopy to reconstruct three-dimensional tissue nanostructure. PLoS Biol. 2, e329 (2004).
- Salih, A., Larkum, A., Cox, G., Kühl, M., Hoegh-Guldberg, O. Fluorescent pigments in corals are photoprotective. Nature. 408, 850-853 (2000).
- Sivaguru, M., Mander, L., Fried, G., Punyasena, S. W. Capturing the surface texture and shape of pollen: A comparison of microscopy techniques. PloS one. 7 (6), (2012).
- Helmchen, F., Denk, W. Deep tissue two-photon microscopy. Nat. Methods. 2, 932-940 (2005).
