Multimodal שיטות מיקרוסקופית אופטיות לחשוף רקמות מורפולוגיה ומבנה פוליפ בקריביים אלמוגי בניית ריף
Summary
חבילה משולבת של טכניקות הדמיה יושמה כדי לקבוע מורפולוגיה פוליפ ומבנה רקמה בannularis Montastraea אלמוגי האיים הקריביים ומ ' faveolata. הקרינה, פנים בלוק סדרתי, ומיקרוסקופ סריקת לייזר confocal שני פוטונים זיהו מבנה lobate, קירות פוליפ, וchromatophore מוערך וצפיפויות zooxanthellae והפצות.
Abstract
חבילה משולבת של טכניקות הדמיה יושמה כדי לקבוע את המורפולוגיה תלת ממדים (3D) ומבנה תאי של רקמות פוליפ המרכיב את annularis Montastraea אלמוגי בניין שונית קריביים ומ ' faveolata. גישות אלה כוללות מיקרוסקופ פלואורסצנטי (FM), פנים בלוק סידורי הדמיה (SBFI), ושני הפוטונים במיקרוסקופ לייזר confocal סריקה (TPLSM). SBFI מספק הדמיה רקמות עמוקה לאחר חתך פיזי; זה מפרט את מרקם רקמת פני השטח והדמיית 3D למעמקי רקמות של יותר מ 2 מ"מ. תמונות FM המשלים ותשואת TPLSM רזולוציה גבוהה במיוחד של מבנה תאי של רקמה. תוצאות: (1) זיהו מורפולוגיות רקמת lobate לא פורסם בעבר על הקיר החיצוני של פוליפים אלמוגים בודדים ו( 2) יצר את מפות השטח הראשונות של צפיפות הפצת 3D ורקמות של chromatophores וendosymbionts zooxanthellae dinoflagellate כמו אצות. אפונה קליטת ספקטרליks של 500 ננומטר ו675 ננומטר, בהתאמה, מצביע על כך שמ ' annularis ומ ' faveolata מכיל סוגים דומים של כלורופיל וchromatophores. עם זאת, מ ' annularis ומ ' faveolata להציג הבדלים משמעותיים בצפיפות הרקמה והפצת 3D של מרכיבים התאיים מפתח אלה. מחקר זה מתמקד בשיטות הדמיה מצביע על כך שSBFI הוא מאוד שימושי עבור ניתוח של דגימות מ"מ בקנה מידה גדולות של רקמות אלמוגי decalcified. FM טיפוח וTPLSM לחשוף עדינים שינויים בקנה מידה submillimeter בהפצה וצפיפות תאיות בדגימות רקמת אלמוגי nondecalcified. טכניקת TPLSM מקנה: (1) הכנה פולשנית מדגם, (2) יכולת חתך אופטית מעולה, ו (3) קליטת אור מינימאלית ופיזור, בזמן שעדיין מאפשר הדמיה רקמות עמוקה.
Introduction
התחממות כדור הארץ ושינוי סביבתי נלווה באופן ישיר משפיעים על הבריאות והפצה של אלמוגים ימיים הטרופיים 1-4. השפעות מרובות נתונים למעקב, כולל הלבנת אלמוגים ואת הופעתה של מחלות זיהומיות 5-6. עם זאת, חיזוי מדויק יותר של תגובת אלמוגים בעתיד לאיומים הסביבתיים האלה ידרוש מ" קו בסיס "היסטולוגית יוקם, המגדיר את מורפולוגיה רקמות והרכב תא והפצה לאלמוגים" בריאים לכאורה ". בתורו, "השפיע" אלמוגים אז יכולים להיות בהשוואה כמותית. יתר על כן, נקודת התחלה זו יש לקבוע לאלמוגים בריאים לכאורה תחת מגוון רחב של תנאים סביבתיים, כך ש" תגובה בריאה "יכולה להיות גם תעיד על פני מילויים סביבתיים. כצעד ראשון להקמת קו בסיס זה, מחקר 3D ברזולוציה גבוהה כבר התחייב לאופן שככל הנראה רקמת פוליפ אלמוגים בריאיםמורפולוגיה והרכב סלולארי מגיבים לעליות בעומק מים (WD) וירידות המלוות בקרינת אור שמש. תוצאות לאחר מכן ניתן להשתמש כדי להקים הבנת מכניסטית מקיפה יותר של הסתגלות אלמוגים, כמו גם כדי לקבל תובנה האבולוציה אלמוגים-הסימביונט והשיפור של קצירת אור.
אלמוגי אבן (Scleractinia) הם בעלי חיים חסרי חוליות ימיות קולוניאליים שישחקו לארח מכלול מורכב של מיקרואורגניזמים אחרים, המכונה באופן קולקטיבי האלמוגים holobiont 7-10. המחקר שנעשה במחקר הנוכחי מבקש להשתמש חבילה של טכנולוגיות הדמיה החדשנית כדי לעקוב אחר שינויים בו זמנית עם עומק הגדלת מים בפיגמנטים הרקמה וzooxanthellae הסימביוטי של אלמוגי מארח בריאים לכאורה. זה יקימו "קו הבסיס" תא רקמה השוואתית הנדרש על פני שיפוע מדידת עומק לאלמוגים בריאים לכאורה ולפעול כמדדים של חימום אלמוגיםLTH 10. פיגמנטים אלמוגים, chromatophores נקרא, לפעול לקליטה, משקפים, פיזור, לשבור, diffract, או להתערב בדרך אחרת עם קרינת שמש תקרית 11. יחסי endosymbiotic zooxanthellae-chromatophore אפשרו האבולוציה המשותפת של אופטימיזציה אור קציר יתרון אסטרטגי ואסטרטגיות צמיחת שלד, כמו גם גמישות טרופית (אסטרטגיות ציד הסטה קדימה ואחורה מautotrophy לheterotrophy) לבעלי חי האלמוגים 12.
האומה דרום האיים הקריביים האי קוראסאו (לשעבר חלק מהאנטילים ההולנדיים) שוכנת כ 65 קילומטר צפוני ונצואלה בתוך ממזרח למערב במגמת ארכיפלג (איור 1 א) ארובה-La Blanquilla. החוף הדרומי הארוך 70 קילומטר קוראסאו מכיל מערכת שונית אלמוגים רצופה מודרנית והמיוקן-הפליוקן-הפלייסטוקן-ההולוקן fringing העתיק 13,14. אומר SST השנתי על קוראסאו משתנה כ 3 ° Cnually, הנע בין מינימום של 26 מעלות צלזיוס בסוף ינואר למקסימום של 29 ° C בתחילת ספטמבר, עם טמפרטורה שנתית ממוצעת של 27.5 ± 0.5 ºC (NOAA SST נתונים סטים, 2000-2010). שונית האלמוגים בPlaya Kalki (12 ° 22'31.63 "N, 69 ° 09'29.62" W), שוכבת ליד הקצה הצפון מערבי של קוראסאו (איור 1 א), נבחרה לדגימה כי זה כבר בעבר גם נלמד ו המערכת האקולוגית ימית במיקום זה היא טובל במי ים 7,15-19 nonpolluted טריים. . שני מינים קרובים scleractinian אלמוגים, annularis מ 'וM faveolata, נבחרו לניסויים וניתוח במחקר זה, כי כל מין: (1) חלוקת מדידת עומק מוצגים שונה וnonoverlapping מובהקות על מערכת השונית ביחס להפסקה והמדף סביבות הצטברות משקע פחמה קשורות (טווח annularis מ = 0-10 מ 'WD; faveolata מ'טווח = 10-20 מ 'WD 20; 1B דמויות, 2A, 2B ו); (2) הוא בונה מסגרת שונית אלמוגים נפוצים בכל הים הקריבי 21; ו (3) חקר היטב אקולוגי, פיסיולוגי, ויחסים האבולוציוניים 22.
דגימת שדה למחקר הנוכחי נערכה תוך שימוש בטכניקות צלילה סטנדרטית מהחוף של Playa Kalki בקוראסאו. חתך מדידת עומק מים רדוד לעמוק נקבע כי חצו בריצה את המדף, על הפסקת המדף, ולתוך סביבות שונית קדמי מים עמוקות. כנראה ראשי אלמוגים בריאים לאחר מכן זיהו לדגימה לאורך חתך מדידת עומק זה, ובכלל זה: (1) שלוש בודד ~ 1 מ 'ראשי אלמוגים בקוטר של מ' annularis, שכולן היו בשעה 5 מ 'עומק מים (WD); ו (2) שלושה בודדים ~ 1 מ 'ראשי אלמוגים בקוטר של מ' faveolata, שכולן היו ב12 מ WD. קרינה פעילה Photosynthetically (PAR) נמדדה כ33-36% P AR ב 5 מ 'WD וPAR% 18-22 ב10 מ WD. דגימה התבצעה בחודש ינואר כאשר SST היה 26 ° C במעמקי המים של שני מ '5 מ' ו12. כל אחד מששת ראשי האלמוגים אלה ידגם בשלושה עותקים בעמדות מרחבי מקבילים (כלומר., 45 כ ° קו רוחב N בכל אחד מששת ראשי האלמוגים חצי כדור). כל דגימה בודדת מורכבת מביופסית 2.5 סנטימטר קוטר אלמוגי רקמות שלד ליבה שנאסף עם אגרוף קשת ניקה. שלוש ביופסיות רקמות שלד אלמוגי נדגמו בצלילה רגילה עם ידיים בכפפות מכל אחד מראשי האלמוגים (9 מ 'מannularis מושבות ב5 מ WD ו -9 ממ faveolata ב12 מ WD). מייד עם אוסף בעומק, כל דגימת ליבת הביופסיה הוצבה בצינור צנטריפוגות פוליפרופילן 50 מ"ל סטרילי, בורג העליון אטום, וחזר אל פני השטח. מי הים היה יצק מכל צינור צנטריפוגות וכל ביופסיה ליבה הייתה שקוע אז, מאוחסנת, ומועברת בparaformaldehyde 4%.
<p class="Jove_content"> ההדמיה SBFI כבר בעבר בוצע על מגוון רחב של דגימות ביולוגיות, כוללים מוח כולו ורקמות אנושיות כולו לב, עוברי עכבר ללא פגע, עוברי דגי זברה, וסוגים רבים של דגימות של בעלי חיים עם עצמות שלמות 23-30. רוב המחקרים הללו מנוצלים אופטי מיקרוסקופ אור / עם או הקרינה או טכניקות שדה בהירות. עם זאת, מחקרים שנערכו בהגדלה גבוהה במיוחד תוך שימוש באלקטרונים סורק בלוק סדרתי פנים הדמיה ביום 31 בעבר. במחקר הנוכחי, פרוטוקול SBFI שונה פותח ולמוחל על אלמוגים בפעם הראשונה. כי מ ' annularis ומ ' פוליפים אלמוגי faveolata הם 1-2 מ"מ עובי, אף אחד משיטות מיקרוסקופיה אור השגרה יהיה מסוגל לחדור את כל העובי של רקמת פוליפ האלמוגים. לכן, יש לנו פרוטוקול הכנת מדגם SBFI שתוכנן במיוחד עבור דגימות אלמוגים. בנוסף, יש לנו מנהג שנועד בעל סטראו, אשר ממונע לנוע בשני כיווני x ו y. מנגנון זה לוקח תמונות של הפנים הבלוק של המדגם ולא איסוף החלקים באמצעות microtome רגיל מול מיקרוסקופ. אנחנו גם הצגנו טכניקה נוספת אופטית קוי שני פוטונים מיקרוסקופיות לתמונה אותה הפוליפים אלמוגים בכל העובי של רקמות האלמוגים. זה מתגבר על המגבלות שהוטלו על ידי SBFI במונחים של decalcification ואפשרות לשינויים במורפולוגיה רקמות ונפח (התכווצות) שעלול להיגרם על ידי הכנת מדגם (התייבשות) ופרוטוקולי עיבוד. יתר על כן, פרופילי הפליטה מהאלמוגים היו ספקטרלי החליטו לזהות את פליטת השיא והווריאציות שלהם בין chromatophores וzooxanthellae הפוטוסינתזה. תוצאות אלו הוערכו בהקשר של השיטה והיתרונות האישיים שלהם בנוגע לזמן רכישה, זמן ניתוח, ואת היכולת לפתור פרטים מבניים בסדר מבלי להתפשר על strשלמות uctural של רקמת האלמוגים.Protocol
Representative Results
Discussion
מחקר שונית אלמוגים הוא מאמץ מחקר בינתחומי מאוד, הכולל ניתוח של פיזי, כימי בו זמנית, ותופעות ביולוגיות הפועלים בסביבה הימית. המחקר של מערכות אקולוגיות שונית אלמוגים מורכבות לכן הטוב ביותר יושלם בתוך מעצמות של עשרה 'מסגרת ההקשרים (איור 10). אוסף גרפי זו ממחיש ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Donna Epps, histologist at Institute for Genomic Biology, University of Illinois Urbana-Champaign (UIUC), for her capable technical assistance in sample preparation and sectioning. This work was supported by a research grant to B.W. Fouke from the Office of Naval Research (N00014-00-1-0609). In addition, C.A.H. Miller received grants from the UIUC Department of Geology Wanless Fellowship, UIUC Department of Geology Leighton fund and UIUC Department of Geology Roscoe Jackson fieldwork fund. Interpretations presented in this manuscript are those of the authors and may not necessarily represent those of the granting institutions. We also thank the Caribbean Research and Management of Biodiversity (Carmabi) laboratory on Curaçao for their support and collaboration in collecting the coral tissue biopsy samples. We thank Claudia Lutz, IGB Media Communication Specialist for her able language correction.
Materials
| Coral Tissue Skeleton | None | None | 2.5 cm Biopsy from natural habitat |
| Arch Punch Coring Device | C.S. Osborne and Company | No. 149 | For Coral biopsy collection |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | RT 15700 | 16% Pre-diluted |
| Histoclear/Safeclear II | Electron Microscopy Sciences | RT 64111-04 | Non-Toxic alternate to Xylene, Dehydration and Deparafinization |
| Xylene and Ethanol | Fisher Scientific | Fisher Scientific | Dehydration |
| Paraffin Wax | Richard Allen Scientific | Type H REF 8338 | Infiltration solution |
| Vybar | The Candle Maker | None | Component of Red Wax |
| Stearin | The Candle Maker | None | Component of Red Wax |
| Sudan IV | Fisher Chemical | S667-25 | Red Wax-Opaque background |
| Wheat Germ Agglutinin (WGA) | Life Technologies | W32466 | For labeling Coral Mucus |
| Prolong Gold | Life Technologies | P36095 | Anti-fade mounting media |
| Fluoro Dish | World Precision Instruments | FD-35-100 | For two-photon imaging |
| XY Motor, Driver and Controller | Lin Engineering | 211-13-01R0, R325, R256-RO | XY Translational Movement |
| Hot Plate | Corning | DC-220 | Melting all wax |
| Convection Oven | Yamato | DX-600 | Infiltration and Embedding |
| Tissue Processor | Leica | ASP 300 | Dehydration, Infiltration |
| Microtome | Leica | RM2055 | Disposable knifes |
| Stereo Microscope | Carl Zeiss | Stereolumar V 12 | 1.5x (30 mm WD) Objective |
| Fluorescence Microscope with ApoTome | Carl Zeiss | Axiovert M 200, ApoTome I System | Imaging thin section of a polyp: Zooxanthellae |
| Axiocam camera | Carl Zeiss | MRm | Monochrome camera 1388×1040 pixels |
| Axiovision Software | Carl Zeiss | Version 4.8 | Image acquisition program |
| Two-Photon Laser | Spectraphysics | Maitai eHP, pulsed laser (70 fs) | With DeepSee module |
| Laser Scanning Microscope | Carl Zeiss | LSM 710 with Spectral Detector | 34 channel PMT detection |
| Zen Software | Carl Zeiss | 2010 or above | for two-photon and spectral image acquisition |
| Imaris Suite Software | Bitplane, Inc., | Version 7.0 or above | 3D Volume, Iso-surface Rendering, Visualization |
References
- Stocker, T. F., Qin, D., Plattner, G. -. K., Tignor, M., Allen, S. K., Boschung, J., Nauels, A., Xia, Y., Bex, V., Midgley, P. M. . Climate Change 2013: The Physical Science Basis. Contribution of Working Group I to the Fifth Assessment Report of the Intergovernmental Panel on Climate Change. , 1535 (2013).
- Buddemeir, R. W., Kleypas, J. A., Aronson, R. B. . Coral Reefs & Global Climate Change: Potential Contributions of Climate Change to Stresses on Coral Reef Ecosystems). 46, (2004).
- Wilkinson, C. . Status of coral reefs of the world. , 1-2 (2004).
- Lough, J. M. Climate records from corals. WIREs Clim. Chang. 1, 318-331 (2010).
- Harvell, C. D., et al. Tropical Archaea: diversity associated with the surface microlayer of corals. Mar. Ecol. Prog. Ser. 273, 81-88 (2004).
- Rosenberg, E., Loya, Y. . Coral Health and Disease. , (2004).
- Rohwer, F., Breitbart, M., Jara, J., Azam, F., Knowlton, N. Diversity of bacteria associated with the Caribbean coral Montastrea franksi. Coral Reefs. 20, 85-91 (2001).
- Frias-Lopez, J., Zerkle, A. L., Bonheyo, G. T., Fouke, B. W. Partitioning of bacterial communities between seawater and healthy, black band diseased, and dead coral surfaces. Appl. Environ. Microbiol. 68, 2214-2228 (2002).
- Stanley, G. D. The evolution of modern corals and their early history. Earth Sci. Rev. 60, 195-225 (2003).
- Piggot, A. M., Fouke, B. W., Sivaguru, M., Sanford, R., Gaskins, H. R. Change in zooxanthellae and mucocyte tissue density as an adaptive response to environmental stress by the coral Montastraea annularis. Mar. Biol. 156, 2379-2389 (2009).
- Stanley, G. D. Photosymbiosis and the evolution of modern coral reefs. Evolution. 1, 3 (2006).
- Gordon, B. R., Leggat, W. Symbiodinium—Invertebrate Symbioses and the Role of Metabolomics. Mar. Drugs. 8, 2546-2568 (2010).
- Schlichter, D., Weber, W., Fricke, H. W. A chromatophore system in the hermatypic, deep-water coral Leptoseris fragilis (Anthozoa: Hexacorallia). Marine Biology. 89, 143-147 (1994).
- Fouke, B. W., Meyers, W. J., Hanson, G. N., Beets, C. J. Chronostratigraphy and dolomitization of the Seroe Domi Formation, Curacao, Netherlands Antilles. Facies. 35, 293-320 (1996).
- Frias-Lopez, J., Bonheyo, G. T., Jin, Q., Fouke, B. W. Cyanobacteria associated with coral black band disease in Caribbean and Indo-Pacific reefs. Appl. Environ. Microbiol. 69, 2409-2413 (2003).
- Frias-Lopez, J., Klaus, J., Bonheyo, G. T., Fouke, B. W. The bacterial community associated with black band disease in corals. Appl. Environ. Microbiol. 70, 5055-5062 (2004).
- Frias-Lopez, J., Bonheyo, G. T., Fouke, B. W. Identification of differential gene expression in bacteria associated with coral black band disease using RNA-arbitrarily primed PCR. Appl. Environ. Microbiol. 70, 3687-3694 (2004).
- Klaus, J. S., Frias-Lopez, J., Bonheyo, G. T., Heikoop, J. M., Fouke, B. W. Bacterial communities inhabiting the healthy tissues of two Caribbean reef corals: interspecific and spatial variation. Coral Reefs. 24, 129-137 (2005).
- Klaus, J., Janse, I., Sandford, R., Fouke, B. W. Coral microbial communities, zooxanthellae, and mucus along gradients of seawater depth and coastal pollution. Environ. Microbiol. 9, 1291-1305 (2007).
- van Duyl, F. C. . Atlas of the living reefs of Curacao and Bonaire (Netherlands Antilles). , (1985).
- Carricart-Ganivet, J. P. Sea surface temperature and the growth of the West Atlantic reef building coral Montastraea annularis. J. Exp. Mar. Biol. Ecol. 302, 249-260 (2004).
- Barnes, D. J., Lough, J. M. Coral skeletons: Storage and recovery of environmental information. Global Chang. Biol. 2, 569-582 (1996).
- Mohun, T. J., Weninger, W. J. Generation of volume data by episcopic three-dimensional imaging of embryos. Cold Spring Harbor Protocols. 6, 069591 (2012).
- Mohun, T. J., Weninger, W. J. Imaging heart development using high-resolution episcopic microscopy. Curr. Opin. Genet. Dev. 21, 573-578 (2011).
- Mohun, T. J., Weninger, W. J. Embedding embryos for episcopic fluorescence image capturing (EFIC). Cold Spring Harb. Protoc. 6, 069575 (2012).
- Rosenthal, J., et al. Rapid high resolution three dimensional reconstruction of embryos with episcopic fluorescence image capture. Birth Defects Res. C: Embryo Today: Rev. 72, 213-223 (2004).
- Slyfield, C. R., et al. Three-dimensional surface texture visualization of bone tissue through epifluorescence-based serial block face imaging. J. Microsc. 236, 52-59 (2009).
- Weninger, W., Mohun, T. Phenotyping transgenic embryos: a rapid 3-D screening method based on episcopic fluorescence image capturing. Nat. Genet. 30, 59-65 (2001).
- Weninger, W., Mohun, T. . Three-dimensional analysis of molecular signals with episcopic imaging techniques. Reporter Genes. , 35-46 (2007).
- Gerneke, D. A., et al. Surface imaging microscopy using an ultramiller for large volume 3D reconstruction of wax-and resin-embedded tissues. Microsc. Res. Tech. 70, 886-894 (2007).
- Denk, W., Horstmann, H. Serial block-face scanning electron microscopy to reconstruct three-dimensional tissue nanostructure. PLoS Biol. 2, e329 (2004).
- Salih, A., Larkum, A., Cox, G., Kühl, M., Hoegh-Guldberg, O. Fluorescent pigments in corals are photoprotective. Nature. 408, 850-853 (2000).
- Sivaguru, M., Mander, L., Fried, G., Punyasena, S. W. Capturing the surface texture and shape of pollen: A comparison of microscopy techniques. PloS one. 7 (6), (2012).
- Helmchen, F., Denk, W. Deep tissue two-photon microscopy. Nat. Methods. 2, 932-940 (2005).
