복합 광학 현미경 방법 카리브 암초 건물 산호의 폴립 조직 형태와 구조를 밝히기
Summary
영상 기술의 통합 제품군은 카리브해 산호 Montastraea의 annularis와 M.에서 용종의 형태와 조직 구조를 결정하기 위해 적용되었습니다 faveolata. 형광, 직렬 블록 얼굴, 및이 광자 공 초점 레이저 주사 현미경 lobate 구조 용종 벽 및 예상 chromatophore 및 주산 셀러 밀도 및 분포를 확인했다.
Abstract
이미징 기술의 통합 스위트 카리브해 암초 건물 산호 Montastraea의 annularis 및 M. 이루어지는 3 차원 (3D) 형태학 및 용종 조직의 세포 구조를 결정하기 위해 적용되어왔다 faveolata. 이러한 접근은 형광 현미경 (FM), 시리얼 블록 얼굴 영상 (SBFI), 및 2 광자 공 초점 레이저 주사 현미경 (TPLSM)를 포함한다. SBFI 물리적 절편 후 깊은 조직 이미징을 제공한다; 그것은 이상 2mm의 조직 깊이에 조직 표면의 질감과 3D 시각화에 대해 자세히 설명합니다. 조직 세포 구조의 보완 FM 및 TPLSM 수율은 매우 높은 해상도의 이미지. 결과가있다 : (1) 외부 개별 산호 폴립의 벽에 이전에보고되지 않은 lobate 조직 형태학을 확인 (2) 색소, 조류와 같은 dinoflagellate의 주산 셀러의 endosymbionts의 3 차원 분포와 조직 밀도의 제 1면지도를 만들었습니다. 스펙트럼 흡수 완두콩500 nm 내지 675 nm 인 KS는 각각 제안 M. annularis와 M. faveolata 엽록소와 색소의 유사한 유형을 포함. 그러나, M. annularis와 M. 조직 밀도와 이러한 주요 세포 구성 요소의 3 차원 분포의 유의 한 차이를 나타내지 faveolata. 이미징 방법에 초점을 맞춘이 연구는 SBFI이 탈회 산호 조직의 큰 mm 크기의 샘플의 분석에 매우 유용 있음을 나타냅니다. 무료 FM 및 TPLSM는 nondecalcified 산호 조직 샘플에서 세포의 분포와 밀도의 미묘한 서브 밀리미터 규모의 변화를 알 수있다. TPLSM 기법 수득한다 : (1) 최소 침습 샘플 준비, (2) 우수한 광 단면 처리 능력, (3) 최소의 광 흡수 및 산란, 여전히 깊은 티슈 이미징을 허용하면서.
Introduction
지구 온난화 및 첨부 환경의 변화는 직접적으로 열대 해양 산호 1-4의 건강 및 유통에 영향을 미치는됩니다. 여러 영향 산호 표백 및 전염병 5-6의 출현을 포함하여 관찰되고있다. 그러나 이러한 환경 적 위협에 대한 미래 산호 응답의보다 정확한 예측은 조직 학적 "베이스 라인" "건강 해 보이는"산호에 대한 조직의 형태 및 세포 구성과 분포를 정의하는 설립하는 것이 필요합니다. 차례로, 산호가 다음 정량적으로 비교 될 수있다 "영향". "정상 응답이"또한 환경에 걸쳐 구배 계측 할 수 있도록 또한,이 기준선은, 다양한 환경 조건 하에서 외관상 건강한 산호 대해 확립되어야한다. 이 기준선을 설정 향한 초기 단계로서, 고해상도 3D 연구는 어떻게 외관상 건강한 산호 폴립 조직 수행되었다형태와 세포 조성물은 햇빛 조사량에서 수심의 증가 (WD) 및 첨부 감소에 응답합니다. 결과는 다음 산호 적응 기작보다 포괄적 이해를 설정할뿐만 아니라, 산호 공생 진화 통찰력과 광 수확의 향상을 얻기 위해 이용 될 수있다.
스토니 산호 (Scleractinia)는 공동으로 산호 7-10 holobiont이라 다른 미생물의 복잡한 조립, 호스트를 재생 식민지 해양 무척추 동물이다. 본 연구에서 수행 연구는 동시에 조직 색소의 증가 수심 분명히 건강한 호스트 산호의 공생 주산 셀러와 변경 사항을 추적하기 위해 최첨단 영상 기술의 제품군을 사용하고자한다. 이 산호 난방의 지표로 분명히 건강한 산호와 행위에 대해 수심 그라데이션을 통해 필요한 비교 조직 셀 "기준"을 설정합니다LTH 10. 산호 안료라는 색소가 흡수, 반영, 산란, 굴절, 회절, 또는 다른 사건 태양 복사 11을 방해하는 역할을합니다. 주산 셀러 – chromatophore endosymbiotic 관계는 산호 동물 (12)에 대해 전략적으로 유리한 빛 수확 최적화 및 골격 성장 전략의 공진화뿐만 아니라 영양 소성 (시프트 공급 전략 autotrophy가 heterotrophy까지 앞뒤로)를 사용할 수있다.
쿠라 카오 남부 카리브해 섬 국가 (네덜란드 령 앤 틸리 스의 이전 부분) 아루바 라 Blanquilla 열도 (그림 1A)를 동향 동서 내에서 약 65km 북쪽 베네수엘라있다. 쿠라 카오 70km 긴 남쪽 해안은 현대 지속적이고 중신 – 플라이오세 – 플라이 스토 홀로 세 고대의 언저리 산호초 기관 13, 14이 포함되어 있습니다. 큐라는 약 3 ° C 형을 변화에 연간 SST 평균nually, 27.5 ± 0.5 ºC의 연간 평균 온도, 9 월 초에 29 ° C의 최대 월 말에서 26 ° C의 최소에 이르기까지 (NOAA SST 데이터 것은 2000년부터 2010년까지 설정합니다). 이전에 잘 공부 되었기 때문에 큐라 (그림 1A)의 북서쪽 끝에 근처에 누워 야 Kalki에서 산호초 (12 ° 22'31.63 "N, 69 ° 09'29.62"W)는, 샘플링에 선정되었다 이 위치에서 해양 생태계 신선한 nonpolluted 해수 7,15-19에서 목욕을합니다. . 두 밀접하게 관련 scleractinian 산호 종, M.의 annularis 및 M faveolata,이 연구에서 실험과 분석을 위해 선택되었다 각 종 때문에 (1) 선반 휴식과에 대한 암초 기관에 전시 분명히 다른과 겹치지 않는 수심 분포 관련 탄산염 퇴적 퇴적 환경 (M.의 annularis 범위 = 0-10미터 WD, M.의 faveolata범위 = 10~20m WD 20,도 1B, 2A 및 2B); (2) 카리브해 (21)에 걸쳐 공통의 산호초 프레임 워크 빌더입니다; (3) 잘 연구 된 생태 학적, 생리 학적, 진화 관계 (22)이있다.
본 연구를위한 필드를 샘플링은 해외 쿠라에 플라 야 Kalki의 표준 스쿠버 다이빙 기술을 사용하여 실시 하였다. 얕은 – 투 – 심해 해저 지형의 횡단면은 선반 휴식을 통해, 선반 가로 질러 그 설립하고, 깊은 물 이물 암초 환경으로 하였다. (1) 세 개인 M.의 ~ 1m 직경 산호 머리 : 분명히 건강한 산호 헤드는 다음을 포함하여이 수심 횡단면을 따라 샘플링 확인되었다 5m 수심 (WD)에 있었다 모두 annularis; M.의 (2) 개별 세 ~ 1m 직경 산호 머리 faveolata는 모두 12m WD에 있었다. 광합성 활성 복사 (PAR)는 33-36% P로 측정 하였다5m WD에서 AR과 10m WD에서 18-22%의 PAR. SST는 5m와 12m 모두의 수심에서 26 ° C를 때 샘플링 년 1 월에 실시했다. 이 여섯 산호 헤드의 각 (즉,. 육 반구형 산호 머리에 각각 약 45 ° N 위도) 동일한 공간 위치에 세중 샘플링했다. 각각의 샘플은 청소 아치 펀치 수집 2.5 cm 직경 산호 조직의 골격 코어 생검으로 구성되었다. 세 산호 조직의 골격 조직 검사가 산호 머리에서 각각 장갑을 낀 손으로 표준 SCUBA에서 샘플링되었다 (M. 9은 5m WD에서 식민지를 annularis 및 M.에서 9 12m WD에서 faveolata). 즉시 깊이에서 수령시, 각 조직 검사 코어 시료를 멸균 50 ㎖의 폴리 프로필렌 원심 분리 관에 넣고, 나사 정상은 밀봉하고, 표면에 돌아왔다. 해수 각 원심 관으로부터 경사 분리하고, 각 코어 생검 후, 침지 저장, 4 % 파라 포름 알데히드로 이송 하였다.
<p class="jove_content은"> SBFI 영상은 이전에 전체 뇌 및 전체 심장 인체 조직, 그대로 마우스 배아, 얼룩말 물고기 배아, 그대로 뼈 23-30와 동물 샘플의 여러 유형을 포함하여 생물학적 시료의 넓은 범위에서 수행되었다. 형광 또는 시야 기법 중 하나와 광학 / 광학 현미경을 이용 이러한 연구의 대부분. 그러나, 연구는 지난 31 년 사형 전자 시리얼 블록 얼굴 영상을 사용하여 초고 배율에서 수행되고있다. 본 연구에서, 변성 SBFI 프로토콜이 개발되었으며 처음 산호인가. M. 때문에 annularis와 M. faveolata 산호 폴립은 두께 1-2mm 아르, 루틴 광학 현미경 기술 중 어느 것도 산호 폴립 조직의 전체 두께를 관통 할 수 없을 것입니다. 따라서, 우리는 특히 산호 샘플을 위해 설계 SBFI 샘플 준비 프로토콜을 가지고있다. 또, 정의 실체 홀더를 설계했다x와 y 방향 모두에서 동력 이동된다. 이 장치는 오히려 현미경 앞의 정규 마이크로톰을 사용하는 섹션을 수집하는 것보다 샘플 블록 얼굴의 화상을 얻어. 우리는 또한 산호 조직의 전체 두께에 걸쳐 이미지에 동일한 산호 폴립을 다른 비선형 광학 두 광자 현미경 기술을 소개했다. 이것은 탈회 측면과 시료 전처리 (탈수) 및 프로세싱 프로토콜에 의해 유도 될 수있다 조직 형태학 및 볼륨 (수축)의 변화의 가능성에 의해 부과 SBFI 한계를 극복한다. 또한, 산호에서 배출 프로파일은 스펙트럼 색소와 광합성 주산 셀러 사이에 절정 배출과 변화를 확인하기로 결심 하였다. 이러한 결과는 사용 된 방법의 컨텍스트 및 수집 시간에 관한 개별 장점, 분석 시간, 및 STR을 손상시키지 않고 미세 구조적 세부 사항을 해결하는 능력으로 평가 하였다산호 조직의 uctural 무결성.Protocol
Representative Results
Discussion
산호초 연구는 해양 환경에서 작동을 동시에 물리적, 화학적 분석, 생물학적 현상을 포함하는, 고도의 학제 적 연구 노력이다. 복잡한 산호초 생태계의 연구는 따라서 최선의 상황에 맞는 프레임 워크 (그림 10) '10의 멱수'내에 완료됩니다. 이 그래픽 편집 산호 생태계 차원 공간의 넓은 범위 (10 -9 10 5m)를 다루고 있음을 보여줍니다. 또한,이 운동은 geobiological 필?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Donna Epps, histologist at Institute for Genomic Biology, University of Illinois Urbana-Champaign (UIUC), for her capable technical assistance in sample preparation and sectioning. This work was supported by a research grant to B.W. Fouke from the Office of Naval Research (N00014-00-1-0609). In addition, C.A.H. Miller received grants from the UIUC Department of Geology Wanless Fellowship, UIUC Department of Geology Leighton fund and UIUC Department of Geology Roscoe Jackson fieldwork fund. Interpretations presented in this manuscript are those of the authors and may not necessarily represent those of the granting institutions. We also thank the Caribbean Research and Management of Biodiversity (Carmabi) laboratory on Curaçao for their support and collaboration in collecting the coral tissue biopsy samples. We thank Claudia Lutz, IGB Media Communication Specialist for her able language correction.
Materials
| Coral Tissue Skeleton | None | None | 2.5 cm Biopsy from natural habitat |
| Arch Punch Coring Device | C.S. Osborne and Company | No. 149 | For Coral biopsy collection |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | RT 15700 | 16% Pre-diluted |
| Histoclear/Safeclear II | Electron Microscopy Sciences | RT 64111-04 | Non-Toxic alternate to Xylene, Dehydration and Deparafinization |
| Xylene and Ethanol | Fisher Scientific | Fisher Scientific | Dehydration |
| Paraffin Wax | Richard Allen Scientific | Type H REF 8338 | Infiltration solution |
| Vybar | The Candle Maker | None | Component of Red Wax |
| Stearin | The Candle Maker | None | Component of Red Wax |
| Sudan IV | Fisher Chemical | S667-25 | Red Wax-Opaque background |
| Wheat Germ Agglutinin (WGA) | Life Technologies | W32466 | For labeling Coral Mucus |
| Prolong Gold | Life Technologies | P36095 | Anti-fade mounting media |
| Fluoro Dish | World Precision Instruments | FD-35-100 | For two-photon imaging |
| XY Motor, Driver and Controller | Lin Engineering | 211-13-01R0, R325, R256-RO | XY Translational Movement |
| Hot Plate | Corning | DC-220 | Melting all wax |
| Convection Oven | Yamato | DX-600 | Infiltration and Embedding |
| Tissue Processor | Leica | ASP 300 | Dehydration, Infiltration |
| Microtome | Leica | RM2055 | Disposable knifes |
| Stereo Microscope | Carl Zeiss | Stereolumar V 12 | 1.5x (30 mm WD) Objective |
| Fluorescence Microscope with ApoTome | Carl Zeiss | Axiovert M 200, ApoTome I System | Imaging thin section of a polyp: Zooxanthellae |
| Axiocam camera | Carl Zeiss | MRm | Monochrome camera 1388×1040 pixels |
| Axiovision Software | Carl Zeiss | Version 4.8 | Image acquisition program |
| Two-Photon Laser | Spectraphysics | Maitai eHP, pulsed laser (70 fs) | With DeepSee module |
| Laser Scanning Microscope | Carl Zeiss | LSM 710 with Spectral Detector | 34 channel PMT detection |
| Zen Software | Carl Zeiss | 2010 or above | for two-photon and spectral image acquisition |
| Imaris Suite Software | Bitplane, Inc., | Version 7.0 or above | 3D Volume, Iso-surface Rendering, Visualization |
References
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