Мультимодальные оптической микроскопии Методы Reveal полип Tissue морфологии и структуры в карибских рифовых рифостроители
Summary
Интегрированный набор методов визуализации была применена для определения полипов морфологию и структуру ткани в Карибском кораллы Montastraea annularis и М. faveolata. Флуоресценции, серийный блок лицо, и двухфотонного конфокальной лазерной сканирующей микроскопии выявили структуру лопастные, полипов стены, и расчетное chromatophore и плотности Зооксантелл и распределения.
Abstract
Интегрированный набор методов визуализации была применена для определения трехмерной (3D) морфологию и клеточную структуру с полипами тканей, составляющих Карибское строительные коралловых рифов Montastraea annularis и М. faveolata. Эти подходы включают флуоресцентной микроскопии (FM), серийный блок лица томографии (SBFI) и двухфотонного конфокальной лазерной сканирующей микроскопии (TPLSM). SBFI предоставляет глубоких тканей изображений после физической срезов; это детали текстуры поверхности тканей и 3D визуализацию к глубине тканей более чем на 2 мм. FM комплементарной и выход TPLSM ультра-изображений с высоким разрешением из ткани ячеистой структуры. Результаты были: (1) определены ранее незарегистрированных морфологии лопастные ткани на наружной стене отдельных коралловых полипов и (2) были созданы первые карты поверхности на 3D распределения и ткани плотностью хроматофоров и водорослей, как динофлагеллят Зооксантелл эндосимбионтов. Спектральный гороха поглощенияKS 500 нм и 675 нм, соответственно, предполагают, что M. annularis и М. faveolata содержат аналогичные виды хлорофилла и хроматофоров. Тем не менее, М. annularis и М. faveolata демонстрируют существенные различия в плотности ткани и 3D распределения этих ключевых клеточных компонентов. Это исследование, посвященное методов визуализации показывает, что SBFI чрезвычайно полезен для анализа больших образцов мм-масштабных Декальцинированное коралловых тканей. FM бесплатный и TPLSM выявить тонкие изменения субмиллиметровом масштабе клеточного распределения и плотности в образцах nondecalcified ткани кораллов. Техника TPLSM дает: (1) минимально инвазивной пробоподготовки, (2) превосходит способность оптического секционирования, и (3) минимальное поглощение света и рассеяние, в то же время позволяя визуализации глубоких тканей.
Introduction
Глобальное потепление и сопутствующее изменение окружающей среды непосредственно сказываются на здоровье и распределение тропических морских кораллов 1-4. Наблюдаются множественные удары, в том числе обесцвечивания кораллов и появлением инфекционных заболеваний 5-6. Тем не менее, более точный прогноз будущей кораллового ответ на эти экологических угроз потребует гистологическое "базовый" устанавливается, что определяет тканей морфологию и состав клеток и распределение для «практически здоровых» кораллов. В свою очередь, "влияние" кораллы могут быть количественно по сравнению. Кроме того, эта базовая должны быть установлены для практически здоровых кораллов в различных условиях окружающей среды, так что "здоровая реакция" также можно судить по градиентов окружающей среды. В качестве первого шага на пути к созданию этой базовой линии, 3D исследование высокого разрешения была предпринята, как практически здоровых коралловых полипов тканиморфология и клеточный состав реагирует на увеличение в глубине (WD) и сопровождающие снижением солнечного света излучения. Результаты могут быть использованы для установления более полное механическое понимание коралловый адаптации, а также, чтобы разобраться в коралловом-симбионтов эволюции и усиление света уборки.
Каменистые кораллы (Scleractinia) являются колониальные морские беспозвоночные животные, которые выступают в качестве принимающих сложной сборки других микроорганизмов, совместно именуемые коралл holobiont 7-10. Исследования, проведенные в настоящей работе стремится использовать набор технологий передовые изображений одновременно отслеживать изменения с увеличением глубины в ткани пигментов и симбиотических зооксантелл практически здоровых кораллов принимающих. Это позволит создать необходимый сравнительный ткани клеток "базовый" через батиметрическом градиента для практически здоровых кораллов и выступать в качестве индикаторов кораллового слухLTH 10. Коралловые пигменты, называемые хроматофоры, действовать, чтобы поглотить, отражают, разброс, преломляют, преломлять или иным образом вмешиваться в падающей солнечной радиации 11. Зооксантеллы-chromatophore эндосимбиотических отношения позволило коэволюции стратегически выгодном оптимизации светособирающего и скелетных стратегий роста, а также трофические пластичности (стратегии перехода кормления обратно и вперед от автотрофность в гетеротрофией) для кораллового животного 12.
Южной части Карибского бассейна островное государство Кюрасао (ранее часть Нидерландских Антильских островов) находится примерно в 65 км к северу от Венесуэлы в субширотных Аруба-La Бланкия архипелага (рисунок 1А). 70 км южное побережье Кюрасао содержит непрерывную современный и миоцена-плиоцена-плейстоцена-голоцена древняя окантовкой коралловых рифов тракт 13,14. Среднегодовая SST на Кюрасао варьирует в пределах примерно 3 ° C ANгодно, начиная от минимальной 26 ° С в конце января до максимума 29 ° C в начале сентября, с среднегодовой температуры 27,5 ± 0,5 ºC (NOAA SST наборов данных, 2000-2010). Коралловый риф в Плайя-Калки (12 ° 22'31.63 "N, 69 ° 09'29.62" W), лежа рядом с северо-западной оконечности Кюрасао (Рисунок 1А), был выбран для отбора проб, потому что он был ранее хорошо изученный и Морская экосистема в этом месте купается в пресной nonpolluted морской 7,15-19. . Двух тесно связанных склерактиниевых видов кораллов, М. annularis и M faveolata, были выбраны для экспериментов и анализа в данном исследовании, потому что каждого вида: (1) экспонаты совершенно разных и непересекающиеся батиметрические распределения на рифе тракта по отношению к шельфа и связанные обстановки осадконакопления карбонат осадочные (М. диапазон annularis = 0-10 м WD; М. faveolataДиапазон = 10-20 м WD 20; Фигуры 1В, 2А, и 2В); (2) является общим коралловый риф рамки строителя всем Карибском море 21; и (3) имеет хорошо изученный экологическую, физиологические, и эволюционные отношения 22.
Выборки поле для настоящего исследования была проведена с использованием стандартных методик, ныряя с аквалангом оффшорные Плайя Калки на Кюрасао. Мелкой к глубокой воде батиметрическая трансект было установлено, что натыкался на полке, над шельфа, и в глубоководной среде передних рифов. Видимо здоровые коралловые головы Затем были выявлены для отбора проб по этому батиметрическом разреза, в том числе: (1) три индивидуальный ~ 1 м в диаметре коралловых глав М. annularis, все из которых были на 5 м глубины воды (WD); и (2) три отдельные ~ 1 м в диаметре коралловые руководители М. faveolata, все из которых были в 12 м WD. Фотосинтетически активной радиации (ФАР) измеряли как 33-36% PAR на расстоянии 5 м WD и 18-22% PAR на расстоянии 10 м WD. Отбор проб проводился в январе, когда SST было 26 ° C на глубине как 5 м и 12 м. Каждый из этих шести кораллов отбирали в трех повторах в эквивалентных пространственных положений (то есть., Около 45 ° северной широты на каждой из шести полусферических кораллов). Каждый образец состоял из 2,5 см диаметром ткани кораллов-скелет основной биопсии, что были собраны с очищенной арки удар. Три коралловые ткани-скелет биопсии пробы на стандартный аквалангом с руками в перчатках от каждого из кораллов (9 из М. annularis колонии на расстоянии 5 м WD и 9 из М. faveolata в 12 м WD). Сразу же после сбора на глубине, каждый биопсии образец керна помещали в стерильный 50 мл полипропиленовую центрифужную пробирку, завинчивающейся крышкой запечатан, и возвращается на поверхность. Морская вода сливали из каждой трубки центрифуги и каждое ядро биопсия затем погружают, хранятся и транспортируются в 4% параформальдегида.
<p class="Jove_content"> визуализации SBFI ранее были выполнены в широком диапазоне биологических образцов, в том числе весь мозг и вся-сердечных тканей человека, интактных эмбрионов мыши, зебры эмбрионов рыб, а также несколько типов образцов животных с интактными костей 23-30. Большинство этих исследований, используемых оптический / световой микроскопии либо флуоресценции или методов в светлом поле. Тем не менее, исследования были проведены на очень больших увеличениях с помощью сканирующего электронного серийного блока изображений лица в прошлом 31. В настоящем исследовании, модифицированный протокол SBFI была разработана для и наносили на кораллов в первый раз. Потому М. annularis и М. faveolata коралловые полипы 1-2 мм в толщину, ни один из обычных световых методов микроскопии не было бы способны проникать на всю толщину коралловых полипов ткани. Поэтому, у нас есть SBFI протокол подготовки образца, специально разработанный для коралловых образцов. Кроме того, мы специально созданных держатель Стереомикроскоп, Который моторизованные двигаться в обоих направлениях Х и Y.. Этот аппарат принимает изображения блока грани образца вместо сбора разделы с помощью регулярного микротом перед микроскопом. Мы также представила еще одну нелинейного оптического двухфотонную микроскопическую технику для изображения тех же коралловых полипов по всей толщине коралловых тканей. Это позволяет преодолеть ограничения, налагаемые SBFI в плане удаления накипи и возможностью изменения тканей морфологии и объема (усадки), которые могут быть вызваны пробоподготовки (обезвоживание) и протоколов обработки. Кроме того, профили выбросов от кораллов были спектрально решен определить свои пиковые выбросы и колебания между хроматофоров и фотосинтетического зооксантеллами. Эти результаты были оценены в контексте используемого метода и их отдельных преимуществ в отношении времени приобретения, время анализа, и способности решать мелкие детали строения без ущерба улuctural целостность коралловых ткани.Protocol
Representative Results
Discussion
Коралловый риф исследования является весьма междисциплинарный исследовательский проект, с участием анализ одновременного физических, химических и биологических явлений, которые работают в морской среде. Изучение сложных экосистем коралловых рифов Поэтому лучше завершена в течение…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Donna Epps, histologist at Institute for Genomic Biology, University of Illinois Urbana-Champaign (UIUC), for her capable technical assistance in sample preparation and sectioning. This work was supported by a research grant to B.W. Fouke from the Office of Naval Research (N00014-00-1-0609). In addition, C.A.H. Miller received grants from the UIUC Department of Geology Wanless Fellowship, UIUC Department of Geology Leighton fund and UIUC Department of Geology Roscoe Jackson fieldwork fund. Interpretations presented in this manuscript are those of the authors and may not necessarily represent those of the granting institutions. We also thank the Caribbean Research and Management of Biodiversity (Carmabi) laboratory on Curaçao for their support and collaboration in collecting the coral tissue biopsy samples. We thank Claudia Lutz, IGB Media Communication Specialist for her able language correction.
Materials
| Coral Tissue Skeleton | None | None | 2.5 cm Biopsy from natural habitat |
| Arch Punch Coring Device | C.S. Osborne and Company | No. 149 | For Coral biopsy collection |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | RT 15700 | 16% Pre-diluted |
| Histoclear/Safeclear II | Electron Microscopy Sciences | RT 64111-04 | Non-Toxic alternate to Xylene, Dehydration and Deparafinization |
| Xylene and Ethanol | Fisher Scientific | Fisher Scientific | Dehydration |
| Paraffin Wax | Richard Allen Scientific | Type H REF 8338 | Infiltration solution |
| Vybar | The Candle Maker | None | Component of Red Wax |
| Stearin | The Candle Maker | None | Component of Red Wax |
| Sudan IV | Fisher Chemical | S667-25 | Red Wax-Opaque background |
| Wheat Germ Agglutinin (WGA) | Life Technologies | W32466 | For labeling Coral Mucus |
| Prolong Gold | Life Technologies | P36095 | Anti-fade mounting media |
| Fluoro Dish | World Precision Instruments | FD-35-100 | For two-photon imaging |
| XY Motor, Driver and Controller | Lin Engineering | 211-13-01R0, R325, R256-RO | XY Translational Movement |
| Hot Plate | Corning | DC-220 | Melting all wax |
| Convection Oven | Yamato | DX-600 | Infiltration and Embedding |
| Tissue Processor | Leica | ASP 300 | Dehydration, Infiltration |
| Microtome | Leica | RM2055 | Disposable knifes |
| Stereo Microscope | Carl Zeiss | Stereolumar V 12 | 1.5x (30 mm WD) Objective |
| Fluorescence Microscope with ApoTome | Carl Zeiss | Axiovert M 200, ApoTome I System | Imaging thin section of a polyp: Zooxanthellae |
| Axiocam camera | Carl Zeiss | MRm | Monochrome camera 1388×1040 pixels |
| Axiovision Software | Carl Zeiss | Version 4.8 | Image acquisition program |
| Two-Photon Laser | Spectraphysics | Maitai eHP, pulsed laser (70 fs) | With DeepSee module |
| Laser Scanning Microscope | Carl Zeiss | LSM 710 with Spectral Detector | 34 channel PMT detection |
| Zen Software | Carl Zeiss | 2010 or above | for two-photon and spectral image acquisition |
| Imaris Suite Software | Bitplane, Inc., | Version 7.0 or above | 3D Volume, Iso-surface Rendering, Visualization |
References
- Stocker, T. F., Qin, D., Plattner, G. -. K., Tignor, M., Allen, S. K., Boschung, J., Nauels, A., Xia, Y., Bex, V., Midgley, P. M. . Climate Change 2013: The Physical Science Basis. Contribution of Working Group I to the Fifth Assessment Report of the Intergovernmental Panel on Climate Change. , 1535 (2013).
- Buddemeir, R. W., Kleypas, J. A., Aronson, R. B. . Coral Reefs & Global Climate Change: Potential Contributions of Climate Change to Stresses on Coral Reef Ecosystems). 46, (2004).
- Wilkinson, C. . Status of coral reefs of the world. , 1-2 (2004).
- Lough, J. M. Climate records from corals. WIREs Clim. Chang. 1, 318-331 (2010).
- Harvell, C. D., et al. Tropical Archaea: diversity associated with the surface microlayer of corals. Mar. Ecol. Prog. Ser. 273, 81-88 (2004).
- Rosenberg, E., Loya, Y. . Coral Health and Disease. , (2004).
- Rohwer, F., Breitbart, M., Jara, J., Azam, F., Knowlton, N. Diversity of bacteria associated with the Caribbean coral Montastrea franksi. Coral Reefs. 20, 85-91 (2001).
- Frias-Lopez, J., Zerkle, A. L., Bonheyo, G. T., Fouke, B. W. Partitioning of bacterial communities between seawater and healthy, black band diseased, and dead coral surfaces. Appl. Environ. Microbiol. 68, 2214-2228 (2002).
- Stanley, G. D. The evolution of modern corals and their early history. Earth Sci. Rev. 60, 195-225 (2003).
- Piggot, A. M., Fouke, B. W., Sivaguru, M., Sanford, R., Gaskins, H. R. Change in zooxanthellae and mucocyte tissue density as an adaptive response to environmental stress by the coral Montastraea annularis. Mar. Biol. 156, 2379-2389 (2009).
- Stanley, G. D. Photosymbiosis and the evolution of modern coral reefs. Evolution. 1, 3 (2006).
- Gordon, B. R., Leggat, W. Symbiodinium—Invertebrate Symbioses and the Role of Metabolomics. Mar. Drugs. 8, 2546-2568 (2010).
- Schlichter, D., Weber, W., Fricke, H. W. A chromatophore system in the hermatypic, deep-water coral Leptoseris fragilis (Anthozoa: Hexacorallia). Marine Biology. 89, 143-147 (1994).
- Fouke, B. W., Meyers, W. J., Hanson, G. N., Beets, C. J. Chronostratigraphy and dolomitization of the Seroe Domi Formation, Curacao, Netherlands Antilles. Facies. 35, 293-320 (1996).
- Frias-Lopez, J., Bonheyo, G. T., Jin, Q., Fouke, B. W. Cyanobacteria associated with coral black band disease in Caribbean and Indo-Pacific reefs. Appl. Environ. Microbiol. 69, 2409-2413 (2003).
- Frias-Lopez, J., Klaus, J., Bonheyo, G. T., Fouke, B. W. The bacterial community associated with black band disease in corals. Appl. Environ. Microbiol. 70, 5055-5062 (2004).
- Frias-Lopez, J., Bonheyo, G. T., Fouke, B. W. Identification of differential gene expression in bacteria associated with coral black band disease using RNA-arbitrarily primed PCR. Appl. Environ. Microbiol. 70, 3687-3694 (2004).
- Klaus, J. S., Frias-Lopez, J., Bonheyo, G. T., Heikoop, J. M., Fouke, B. W. Bacterial communities inhabiting the healthy tissues of two Caribbean reef corals: interspecific and spatial variation. Coral Reefs. 24, 129-137 (2005).
- Klaus, J., Janse, I., Sandford, R., Fouke, B. W. Coral microbial communities, zooxanthellae, and mucus along gradients of seawater depth and coastal pollution. Environ. Microbiol. 9, 1291-1305 (2007).
- van Duyl, F. C. . Atlas of the living reefs of Curacao and Bonaire (Netherlands Antilles). , (1985).
- Carricart-Ganivet, J. P. Sea surface temperature and the growth of the West Atlantic reef building coral Montastraea annularis. J. Exp. Mar. Biol. Ecol. 302, 249-260 (2004).
- Barnes, D. J., Lough, J. M. Coral skeletons: Storage and recovery of environmental information. Global Chang. Biol. 2, 569-582 (1996).
- Mohun, T. J., Weninger, W. J. Generation of volume data by episcopic three-dimensional imaging of embryos. Cold Spring Harbor Protocols. 6, 069591 (2012).
- Mohun, T. J., Weninger, W. J. Imaging heart development using high-resolution episcopic microscopy. Curr. Opin. Genet. Dev. 21, 573-578 (2011).
- Mohun, T. J., Weninger, W. J. Embedding embryos for episcopic fluorescence image capturing (EFIC). Cold Spring Harb. Protoc. 6, 069575 (2012).
- Rosenthal, J., et al. Rapid high resolution three dimensional reconstruction of embryos with episcopic fluorescence image capture. Birth Defects Res. C: Embryo Today: Rev. 72, 213-223 (2004).
- Slyfield, C. R., et al. Three-dimensional surface texture visualization of bone tissue through epifluorescence-based serial block face imaging. J. Microsc. 236, 52-59 (2009).
- Weninger, W., Mohun, T. Phenotyping transgenic embryos: a rapid 3-D screening method based on episcopic fluorescence image capturing. Nat. Genet. 30, 59-65 (2001).
- Weninger, W., Mohun, T. . Three-dimensional analysis of molecular signals with episcopic imaging techniques. Reporter Genes. , 35-46 (2007).
- Gerneke, D. A., et al. Surface imaging microscopy using an ultramiller for large volume 3D reconstruction of wax-and resin-embedded tissues. Microsc. Res. Tech. 70, 886-894 (2007).
- Denk, W., Horstmann, H. Serial block-face scanning electron microscopy to reconstruct three-dimensional tissue nanostructure. PLoS Biol. 2, e329 (2004).
- Salih, A., Larkum, A., Cox, G., Kühl, M., Hoegh-Guldberg, O. Fluorescent pigments in corals are photoprotective. Nature. 408, 850-853 (2000).
- Sivaguru, M., Mander, L., Fried, G., Punyasena, S. W. Capturing the surface texture and shape of pollen: A comparison of microscopy techniques. PloS one. 7 (6), (2012).
- Helmchen, F., Denk, W. Deep tissue two-photon microscopy. Nat. Methods. 2, 932-940 (2005).
