Multimodale optische microscopie methoden Reveal Poliep Tissue morfologie en structuur in het Caribisch gebied Reef Building Koralen
Summary
Een geïntegreerde suite van beeldvormende technieken is toegepast op poliep morfologie en weefselstructuur in het Caribisch gebied koralen Montastraea annularis en M. te bepalen faveolata. Fluorescentie, serieblok gezicht, en twee-foton confocale laser scanning microscopie hebben lobbige structuur, poliep muren, en de geschatte chromatophore en zoöxanthellen dichtheid en uitkeringen geïdentificeerd.
Abstract
Een geïntegreerde suite van beeldvormende technieken is toegepast op de driedimensionale (3D) morfologie en celstructuur van poliep weefsel omvattende het Caribische rif vormende koralen Montastraea annularis en M. bepalen faveolata. Deze benaderingen omvatten fluorescentiemicroscopie (FM), serieblok gezicht imaging (SBFI), en twee-foton confocale laser scanning microscopie (TPLSM). SBFI biedt deep tissue imaging na lichamelijke snijden; worden de details van het oppervlak weefsel textuur en 3D-visualisatie om weefsel diepten van meer dan 2 mm. Complementaire FM en TPLSM opbrengst ultra-hoge resolutie beelden van het weefsel cellulaire structuur. Resultaten zijn: (1) geïdentificeerd eerder gemeld lobbige weefsel morfologie op de buitenwand van de individuele koraalpoliepen en (2) creëerde het eerste oppervlak kaarten van de 3D distributie en weefsel dichtheid van chromatoforen en algen-achtige dinoflagellaten zooxanthellae endosymbionts. Spectrale absorptie erwtks van 500 nm en 675 nm, respectievelijk, suggereren dat M. annularis en M. faveolata bevatten gelijkaardige soorten chlorofyl en chromatophores. Echter, M. annularis en M. faveolata vertonen grote verschillen in dichtheid en 3D weefsel verdeling van deze belangrijke cellulaire componenten. Deze studie gericht op beeldvorming methoden geeft aan dat SBFI is uiterst nuttig voor de analyse van grote mm-schaal monsters van ontkalkt koraal weefsels. Gratis FM en TPLSM onthullen subtiele submillimeter schaal veranderingen in de cellulaire distributie en dichtheid in nondecalcified koraal weefselmonsters. De TPLSM techniek verschaft: (1) minimaal invasieve monstervoorbereiding, (2) superieure optische sectie vermogen, en (3) minimaal licht absorptie en verstrooiing, terwijl het toelaat deep tissue imaging.
Introduction
Opwarming van de aarde en de bijbehorende veranderingen in het milieu zijn directe gevolgen voor de gezondheid en de verspreiding van tropische mariene koralen 1-4. Meerdere effecten worden waargenomen, waaronder verbleking van koraal en de opkomst van infectieziekten 5-6. Echter, meer nauwkeurige voorspelling van de toekomstige koraal antwoord op deze bedreigingen voor het milieu vereisen dat een histologische "basislijn" worden opgericht, waardoor weefsel morfologie en cel samenstelling en distributie definieert voor "ogenschijnlijk gezonde" koralen. Op zijn beurt, "impact" koralen dan kwantitatief worden vergeleken. Voorts dient deze basislijn worden vastgesteld voor ogenschijnlijk gezonde koralen onder een scala van milieuomstandigheden, zodat "gezonde reactie" kan ook worden gemeten over milieu-gradiënten. Als een eerste stap in de richting van het opstellen van deze basislijn, heeft een hoge resolutie 3D-studie is uitgevoerd van hoe ogenschijnlijk gezonde koraalpoliep weefselmorfologie en cellulaire samenstelling reageert op toename van de waterdiepte (WD) en de bijbehorende afname van zonlicht instraling. De resultaten kunnen dan gebruikt worden om een uitgebreidere mechanistisch begrip van koraal aanpassing te bepalen en om inzicht in koraal-symbiont ontwikkeling en verbetering van light harvesting krijgen.
Steenkoralen (Scleractinia) zijn koloniale mariene ongewervelde dieren die gastheer spelen om een complexe verzameling van andere micro-organismen, gezamenlijk aangeduid als het koraal holobiont 7-10. Het onderzoek dat in de huidige studie tracht een suite van geavanceerde imaging technologieën gebruiken om tegelijkertijd veranderingen met toenemende waterdiepte in het weefsel pigmenten en symbiotische zoöxanthellen van ogenschijnlijk gezonde gastheer koralen volgen. Dit zal de nodige vergelijkende weefselcel "basislijn" op te richten over een bathymetrische gradiënt voor ogenschijnlijk gezonde koralen en fungeren als indicatoren van koraal heaLTH 10. Koraal pigmenten, genaamd chromatoforen, handelen om te absorberen, te reflecteren, scatter, breken, afbuigen of anderszins interfereren met de invallende zonnestraling 11. De zoöxanthellen-chromatophore endosymbiotic relatie is de co-evolutie van strategisch gunstige light-harvesting optimalisatie en groei van het skelet strategieën, evenals trofische plasticiteit (het verschuiven voerstrategieën heen-en-weer van de autotrofe tot heterotrofie) voor het koraal dier 12 ingeschakeld.
De zuidelijke Caribische eiland natie van Curaçao (voorheen onderdeel van de Nederlandse Antillen) ligt op ongeveer 65 km ten noorden van Venezuela in de oost-west trending Aruba-La Blanquilla archipel (figuur 1A). De 70 km lange zuidkust van Curaçao bevat een doorlopende moderne en Mioceen-Plioceen-Pleistoceen-Holoceen oude fringing koraalrif darmkanaal 13,14. Gemiddelde jaarlijkse SST op Curaçao varieert van ongeveer 3 ° C eenlijks, variërend van een minimum van 26 ° C in eind januari tot een maximum van 29 ° C in het begin van september, met een gemiddelde jaartemperatuur van 27,5 ± 0,5 ° C (NOAA SST datasets 2000-2010). Het koraalrif bij Playa Kalki (12 ° 22'31.63 "N, 69 ° 09'29.62" W), liggen in de buurt van de noordwestelijke puntje van Curaçao (figuur 1A), werd gekozen voor bemonstering, omdat het eerder goed bestudeerde en het is geweest mariene ecosysteem op deze locatie wordt badend in verse nonpolluted zeewater 7,15-19. . Twee nauwverwante scleractinian koralen, M. annularis en M faveolata, werden in deze studie gekozen voor experimenten en analyses omdat elke species: (1) vertoont duidelijk verschillend en overlappende bathymetrische verdelingen op het rif tract ten opzichte van de plank te maken met het geassocieerd carbonaat sedimentaire afzettingsmilieus (M. annularis range = 0-10 m WD; M. faveolatarange = 10-20 m WD 20; Figuren 1B, 2A en 2B); (2) is een veel voorkomende koraalrif kader bouwer gedurende de Caribische Zee 21; en (3) heeft een goed bestudeerde ecologische, fysiologische, en evolutionaire relaties 22.
Veld bemonstering voor de huidige studie werd uitgevoerd met behulp van standaard duiken technieken kust van Playa Kalki op Curaçao. Een ondiepe-tot-diep water bathymetrische transect werd vastgesteld dat liep over de plank, op de plank breken, en in het diepe water voorgrond rif omgevingen. Ogenschijnlijk gezonde koralen werden vervolgens geïdentificeerd voor de bemonstering langs deze bathymetrische transect, waaronder: (1) drie individuele ~ 1 m diameter koraal hoofden van M. annularis, die allemaal op 5 m waterdiepte (WD); en (2) drie individuele ~ 1 m diameter koraal hoofden van M. faveolata, die allemaal op 12 m van WD. Fotosynthetische actieve straling (PAR) werd gemeten als 33-36% PAR op 5 m WD en 18-22% PAR op 10 m van WD. Bemonstering werd uitgevoerd in januari wanneer de SST was 26 ° C aan de waterdieptes van zowel de 5 m en 12 m. Elk van deze zes koralen werd bemonsterd in drievoud bij equivalente ruimtelijke posities (dwz., Ongeveer 45 ° noorderbreedte op elk van de zes halfronde koralen). Elk individueel monster bestond uit een 2,5 cm diameter koraal weefsel-skelet kern biopsie die werd verzameld met een gereinigd boog punch. Drie koraal weefsel-skelet biopten werden bemonsterd op standaard SCUBA met handschoenen uit elk van de koralen (9 van M. annularis kolonies op 5 m WD en 9 van M. faveolata op 12 m WD). Onmiddellijk na verzameling op diepte, werd elke biopsie kernmonster in een steriele 50 ml polypropyleen centrifugebuis gebracht, schroefdop afgesloten en teruggebracht naar de oppervlakte. Het zeewater werd gedecanteerd van elke centrifugebuis en elk monster werd vervolgens ondergedompeld biopsie, opgeslagen en in 4% paraformaldehyde getransporteerd.
<p class="Jove_content"> SBFI imaging eerder is uitgevoerd op diverse biologische monsters, waaronder hele hersenen en het gehele hart menselijke weefsels intact muizenembryo's, zebravis embryo, en meerdere soorten dieren monsters met intacte botten 23-30. De meeste van deze studies gebruikt optische / lichtmicroscopie met ofwel fluorescentie of heldere veld technieken. Echter, zijn de studies uitgevoerd in ultra-hoge vergrotingen behulp van scanning electron serieblok gezicht beeldvorming in het verleden 31. In de onderhavige studie werd een gemodificeerd SBFI protocol ontwikkeld voor en toegepast op koralen voor de eerste keer. Omdat M. annularis en M. faveolata koraalpoliepen zijn 1-2 mm in dikte, zou geen van de routine lichtmicroscopie technieken kunnen doordringen van de gehele dikte van koraalpoliep weefsel. Daarom hebben we SBFI monstervoorbereiding protocol speciaal ontworpen voor koraal monsters. Daarnaast hebben we op maat ontworpen een stereomicroscoop houder, Die gemotoriseerd bewegen in zowel x en y richtingen. Deze inrichting neemt beelden van het blok van het monster dan verzamelen de gedeelten met bijvoorbeeld een microtoom voor de microscoop. We introduceerden ook een ander niet-lineaire optische twee-foton microscopische techniek op de foto dezelfde koraalpoliepen over de hele dikte van het koraal weefsel. Dit overwint de door SBFI gesteld wat ontkalking en de mogelijkheid van veranderingen in weefsel morfologie en volume (krimp) die kan worden geïnduceerd door monstervoorbereiding (dehydratie) en verwerkingsprotocollen beperkingen. Bovendien werden de emissie-profielen uit de koralen spectraal opgelost om hun piek uitstoot en variaties tussen de chromatoforen en de fotosynthetische zoöxanthellen identificeren. Deze resultaten werden in het kader van de methode en de individuele voordelen inzake acquisitie tijd, analysetijd en het vermogen om fijne structurele details lossen zonder afbreuk str geëvalueerductural integriteit van het koraal weefsel.Protocol
Representative Results
Discussion
Koraalrif onderzoek is een sterk interdisciplinair onderzoek inspanning, waarbij de analyse van de gelijktijdige fysieke, chemische en biologische verschijnselen die actief zijn in het mariene milieu. De studie van complexe ecosystemen van het koraalrif is daarom het beste binnen een 'Powers of Ten' contextueel kader (figuur 10). Deze grafische compilatie illustreert dat het koraal ecosysteem omvat een breed scala van ruimtelijke dimensies (10 -9 tot 10 5 m). Bovendien is d…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Donna Epps, histologist at Institute for Genomic Biology, University of Illinois Urbana-Champaign (UIUC), for her capable technical assistance in sample preparation and sectioning. This work was supported by a research grant to B.W. Fouke from the Office of Naval Research (N00014-00-1-0609). In addition, C.A.H. Miller received grants from the UIUC Department of Geology Wanless Fellowship, UIUC Department of Geology Leighton fund and UIUC Department of Geology Roscoe Jackson fieldwork fund. Interpretations presented in this manuscript are those of the authors and may not necessarily represent those of the granting institutions. We also thank the Caribbean Research and Management of Biodiversity (Carmabi) laboratory on Curaçao for their support and collaboration in collecting the coral tissue biopsy samples. We thank Claudia Lutz, IGB Media Communication Specialist for her able language correction.
Materials
| Coral Tissue Skeleton | None | None | 2.5 cm Biopsy from natural habitat |
| Arch Punch Coring Device | C.S. Osborne and Company | No. 149 | For Coral biopsy collection |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | RT 15700 | 16% Pre-diluted |
| Histoclear/Safeclear II | Electron Microscopy Sciences | RT 64111-04 | Non-Toxic alternate to Xylene, Dehydration and Deparafinization |
| Xylene and Ethanol | Fisher Scientific | Fisher Scientific | Dehydration |
| Paraffin Wax | Richard Allen Scientific | Type H REF 8338 | Infiltration solution |
| Vybar | The Candle Maker | None | Component of Red Wax |
| Stearin | The Candle Maker | None | Component of Red Wax |
| Sudan IV | Fisher Chemical | S667-25 | Red Wax-Opaque background |
| Wheat Germ Agglutinin (WGA) | Life Technologies | W32466 | For labeling Coral Mucus |
| Prolong Gold | Life Technologies | P36095 | Anti-fade mounting media |
| Fluoro Dish | World Precision Instruments | FD-35-100 | For two-photon imaging |
| XY Motor, Driver and Controller | Lin Engineering | 211-13-01R0, R325, R256-RO | XY Translational Movement |
| Hot Plate | Corning | DC-220 | Melting all wax |
| Convection Oven | Yamato | DX-600 | Infiltration and Embedding |
| Tissue Processor | Leica | ASP 300 | Dehydration, Infiltration |
| Microtome | Leica | RM2055 | Disposable knifes |
| Stereo Microscope | Carl Zeiss | Stereolumar V 12 | 1.5x (30 mm WD) Objective |
| Fluorescence Microscope with ApoTome | Carl Zeiss | Axiovert M 200, ApoTome I System | Imaging thin section of a polyp: Zooxanthellae |
| Axiocam camera | Carl Zeiss | MRm | Monochrome camera 1388×1040 pixels |
| Axiovision Software | Carl Zeiss | Version 4.8 | Image acquisition program |
| Two-Photon Laser | Spectraphysics | Maitai eHP, pulsed laser (70 fs) | With DeepSee module |
| Laser Scanning Microscope | Carl Zeiss | LSM 710 with Spectral Detector | 34 channel PMT detection |
| Zen Software | Carl Zeiss | 2010 or above | for two-photon and spectral image acquisition |
| Imaris Suite Software | Bitplane, Inc., | Version 7.0 or above | 3D Volume, Iso-surface Rendering, Visualization |
References
- Stocker, T. F., Qin, D., Plattner, G. -. K., Tignor, M., Allen, S. K., Boschung, J., Nauels, A., Xia, Y., Bex, V., Midgley, P. M. . Climate Change 2013: The Physical Science Basis. Contribution of Working Group I to the Fifth Assessment Report of the Intergovernmental Panel on Climate Change. , 1535 (2013).
- Buddemeir, R. W., Kleypas, J. A., Aronson, R. B. . Coral Reefs & Global Climate Change: Potential Contributions of Climate Change to Stresses on Coral Reef Ecosystems). 46, (2004).
- Wilkinson, C. . Status of coral reefs of the world. , 1-2 (2004).
- Lough, J. M. Climate records from corals. WIREs Clim. Chang. 1, 318-331 (2010).
- Harvell, C. D., et al. Tropical Archaea: diversity associated with the surface microlayer of corals. Mar. Ecol. Prog. Ser. 273, 81-88 (2004).
- Rosenberg, E., Loya, Y. . Coral Health and Disease. , (2004).
- Rohwer, F., Breitbart, M., Jara, J., Azam, F., Knowlton, N. Diversity of bacteria associated with the Caribbean coral Montastrea franksi. Coral Reefs. 20, 85-91 (2001).
- Frias-Lopez, J., Zerkle, A. L., Bonheyo, G. T., Fouke, B. W. Partitioning of bacterial communities between seawater and healthy, black band diseased, and dead coral surfaces. Appl. Environ. Microbiol. 68, 2214-2228 (2002).
- Stanley, G. D. The evolution of modern corals and their early history. Earth Sci. Rev. 60, 195-225 (2003).
- Piggot, A. M., Fouke, B. W., Sivaguru, M., Sanford, R., Gaskins, H. R. Change in zooxanthellae and mucocyte tissue density as an adaptive response to environmental stress by the coral Montastraea annularis. Mar. Biol. 156, 2379-2389 (2009).
- Stanley, G. D. Photosymbiosis and the evolution of modern coral reefs. Evolution. 1, 3 (2006).
- Gordon, B. R., Leggat, W. Symbiodinium—Invertebrate Symbioses and the Role of Metabolomics. Mar. Drugs. 8, 2546-2568 (2010).
- Schlichter, D., Weber, W., Fricke, H. W. A chromatophore system in the hermatypic, deep-water coral Leptoseris fragilis (Anthozoa: Hexacorallia). Marine Biology. 89, 143-147 (1994).
- Fouke, B. W., Meyers, W. J., Hanson, G. N., Beets, C. J. Chronostratigraphy and dolomitization of the Seroe Domi Formation, Curacao, Netherlands Antilles. Facies. 35, 293-320 (1996).
- Frias-Lopez, J., Bonheyo, G. T., Jin, Q., Fouke, B. W. Cyanobacteria associated with coral black band disease in Caribbean and Indo-Pacific reefs. Appl. Environ. Microbiol. 69, 2409-2413 (2003).
- Frias-Lopez, J., Klaus, J., Bonheyo, G. T., Fouke, B. W. The bacterial community associated with black band disease in corals. Appl. Environ. Microbiol. 70, 5055-5062 (2004).
- Frias-Lopez, J., Bonheyo, G. T., Fouke, B. W. Identification of differential gene expression in bacteria associated with coral black band disease using RNA-arbitrarily primed PCR. Appl. Environ. Microbiol. 70, 3687-3694 (2004).
- Klaus, J. S., Frias-Lopez, J., Bonheyo, G. T., Heikoop, J. M., Fouke, B. W. Bacterial communities inhabiting the healthy tissues of two Caribbean reef corals: interspecific and spatial variation. Coral Reefs. 24, 129-137 (2005).
- Klaus, J., Janse, I., Sandford, R., Fouke, B. W. Coral microbial communities, zooxanthellae, and mucus along gradients of seawater depth and coastal pollution. Environ. Microbiol. 9, 1291-1305 (2007).
- van Duyl, F. C. . Atlas of the living reefs of Curacao and Bonaire (Netherlands Antilles). , (1985).
- Carricart-Ganivet, J. P. Sea surface temperature and the growth of the West Atlantic reef building coral Montastraea annularis. J. Exp. Mar. Biol. Ecol. 302, 249-260 (2004).
- Barnes, D. J., Lough, J. M. Coral skeletons: Storage and recovery of environmental information. Global Chang. Biol. 2, 569-582 (1996).
- Mohun, T. J., Weninger, W. J. Generation of volume data by episcopic three-dimensional imaging of embryos. Cold Spring Harbor Protocols. 6, 069591 (2012).
- Mohun, T. J., Weninger, W. J. Imaging heart development using high-resolution episcopic microscopy. Curr. Opin. Genet. Dev. 21, 573-578 (2011).
- Mohun, T. J., Weninger, W. J. Embedding embryos for episcopic fluorescence image capturing (EFIC). Cold Spring Harb. Protoc. 6, 069575 (2012).
- Rosenthal, J., et al. Rapid high resolution three dimensional reconstruction of embryos with episcopic fluorescence image capture. Birth Defects Res. C: Embryo Today: Rev. 72, 213-223 (2004).
- Slyfield, C. R., et al. Three-dimensional surface texture visualization of bone tissue through epifluorescence-based serial block face imaging. J. Microsc. 236, 52-59 (2009).
- Weninger, W., Mohun, T. Phenotyping transgenic embryos: a rapid 3-D screening method based on episcopic fluorescence image capturing. Nat. Genet. 30, 59-65 (2001).
- Weninger, W., Mohun, T. . Three-dimensional analysis of molecular signals with episcopic imaging techniques. Reporter Genes. , 35-46 (2007).
- Gerneke, D. A., et al. Surface imaging microscopy using an ultramiller for large volume 3D reconstruction of wax-and resin-embedded tissues. Microsc. Res. Tech. 70, 886-894 (2007).
- Denk, W., Horstmann, H. Serial block-face scanning electron microscopy to reconstruct three-dimensional tissue nanostructure. PLoS Biol. 2, e329 (2004).
- Salih, A., Larkum, A., Cox, G., Kühl, M., Hoegh-Guldberg, O. Fluorescent pigments in corals are photoprotective. Nature. 408, 850-853 (2000).
- Sivaguru, M., Mander, L., Fried, G., Punyasena, S. W. Capturing the surface texture and shape of pollen: A comparison of microscopy techniques. PloS one. 7 (6), (2012).
- Helmchen, F., Denk, W. Deep tissue two-photon microscopy. Nat. Methods. 2, 932-940 (2005).
