Multimodales méthodes optiques Microscopie Reveal Polyp tissus Morphologie et structure dans Caribbean Reef construction Coraux
Summary
Une suite intégrée de techniques d'imagerie a été appliquée pour déterminer polype morphologie et la structure des tissus dans le coraux des Caraïbes Montastraea annularis et M. faveolata. Fluorescence, le visage de bloc série, et à deux photons laser microscopie confocale à balayage ont identifié la structure lobée, murs de polype, et chromatophores estimée et la densité de zooxanthelles et des distributions.
Abstract
Une suite intégrée de techniques d'imagerie a été appliquée pour déterminer le (3D) morphologie tridimensionnelle et la structure cellulaire des tissus des polypes comprenant l'coraux constructeurs de récifs des Caraïbes Montastraea annularis et M. faveolata. Ces approches comprennent la microscopie à fluorescence (FM), le bloc de série visage imagerie (SBFI), et à deux photons laser microscopie confocale à balayage (TPLSM). SBFI fournit des images des tissus profonds après sectionnement physique; Il détaille la texture de surface de tissu et visualisation 3D pour des profondeurs du tissu de plus de 2 mm. FM complémentaire et de rendement de TPLSM images de très haute résolution de la structure cellulaire des tissus. Les résultats ont: (1) identifier les morphologies de tissus lobés non signalés précédemment sur la paroi extérieure de polypes coralliens individuels et (2) a créé les premières cartes de la surface de la densité de la distribution et du tissu 3D de chromatophores et endosymbiontes dinoflagellés zooxanthelles algues comme. Pois d'absorption spectraleks de 500 nm et 675 nm, respectivement, indiquent que M. annularis et M. faveolata contient types de chlorophylle et de chromatophores similaires. Toutefois, M. annularis et M. faveolata présentent des différences significatives dans la densité et la distribution de tissu 3D de ces composants cellulaires essentiels. Cette étude portant sur les méthodes d'imagerie indique que SBFI est extrêmement utile pour l'analyse de grands échantillons mm échelle de tissus coralliens décalcifier. FM gratuit et TPLSM révèlent de subtiles changements d'échelle submillimétrique de la distribution et de la densité cellulaire dans des échantillons de tissus de corail nondecalcified. La technique permet de TPLSM: (1) préparation de l'échantillon à effraction minimale, (2) de capacité supérieure sectionnement optique, et (3) l'absorption de la lumière et de diffusion minimale, tout en permettant l'imagerie des tissus profonds.
Introduction
Le réchauffement climatique et les changements environnementaux accompagnement affectent directement la santé et la distribution des coraux marins tropicaux 1-4. Impacts multiples sont observés, y compris le blanchiment des coraux et l'émergence de maladies infectieuses 5-6. Toutefois, une prévision plus précise de la future réponse de corail à ces menaces environnementales, il faudra qu'une "ligne de base" histologique être établi, qui définit la morphologie des tissus et de la composition de la cellule et de la distribution pour les coraux "apparemment en bonne santé". À son tour, "touchés" coraux peuvent alors être comparés quantitativement. En outre, cette référence devrait être établi pour les coraux apparemment en bonne santé dans une variété de conditions environnementales, de sorte que «réaction saine» peut également être évaluée à travers des gradients environnementaux. Comme un premier pas vers l'établissement de cette base, une étude 3D à haute résolution a été réalisée de façon apparemment tissu polype corallienmorphologie et la composition cellulaire répond à l'augmentation de la profondeur de l'eau (WD) et des baisses d'accompagnement dans la lumière du soleil irradiance. Les résultats peuvent ensuite être utilisées pour établir une compréhension mécaniste plus complet de corail adaptation, ainsi que de mieux comprendre l'évolution de corail symbiote et l'amélioration de la récolte de la lumière.
Coraux durs (Scleractinia) sont coloniales animaux marins invertébrés qui accueillent un assemblage complexe d'autres microorganismes, appelés collectivement le corail holobiont 7-10. Les recherches menées dans la présente étude cherche à utiliser une suite de technologies d'imagerie de pointe pour suivre simultanément des changements avec l'augmentation de la profondeur de l'eau dans les pigments de tissus et de zooxanthelles symbiotiques des coraux d'accueil apparemment en bonne santé. Ceci permettra d'établir le tissu cellulaire comparative "de base" nécessaire dans un gradient bathymétrique des coraux apparemment en bonne santé et agissent comme des indicateurs de corail heaLTH 10. pigments coralliens, appelées chromatophores, agissent pour absorber, de réfléchir, la diffusion, la réfraction, la diffraction, ou interférer avec le rayonnement solaire incident 11. La relation endosymbiotique zooxanthelles-chromatophores a permis la coévolution de l'optimisation lumière de récolte stratégique avantageuse et des stratégies de croissance du squelette, ainsi que la plasticité trophique (stratégies d'alimentation déplacement de va-et-vient de autotrophie à Hétérotrophie) pour l'animal corail 12.
Les Caraïbes île nation sud de Curaçao (anciennement partie des Antilles néerlandaises) se trouve à environ 65 km au nord du Venezuela au sein de l'orientation est-ouest Aruba-La Blanquilla archipel (figure 1A). Le 70 km côte sud de Curaçao contient un ancien récif corallien frangeant partie continue moderne et Miocène-Pliocène-Pléistocène-Holocène 13,14. SST moyenne annuelle sur Curaçao varie d'environ 3 ° C unenuellement, allant d'un minimum de 26 ° C à la fin de Janvier jusqu'à un maximum de 29 ° C au début de Septembre, avec une température annuelle moyenne de 27,5 ± 0,5 ° C (NOAA SST ensembles de données, 2000-2010). Le récif de corail à Playa Kalki (12 ° 22'31.63 "N, 69 ° 09'29.62" W), située près de la pointe nord-ouest de Curaçao (figure 1A), a été choisi pour l'échantillonnage, car il a déjà été bien étudiée et la écosystème marin à cet endroit est baigné dans l'eau de mer non polluée frais 7,15-19. . Deux espèces de coraux scléractiniens étroitement liées, M. annularis et M faveolata, ont été choisis pour l'expérimentation et l'analyse dans cette étude parce que chaque espèce: (1) des expositions très différentes et ne se chevauchent pas distributions bathymétriques sur les voies de récif par rapport à la limite du plateau continental et la milieux sédimentaires carbonate sédimentaires associés (M. gamme annularis = 0-10 m WD, M. faveolatagamme = 10-20 m WD 20; figures 1B, 2A, et 2B); (2) est un corail cadre commun de récif constructeur tout au long de la mer des Caraïbes 21; et (3) est bien étudiée écologique, physiologique, et les relations d'évolution 22.
échantillonnage sur le terrain pour la présente étude a été réalisée en utilisant des techniques de plongée sous-marine au large de standards Playa Kalki à Curaçao. Un bathymétrique de l'eau peu profonde transect à profonde a été établi que traversait le plateau, sur le rebord du plateau, et dans les environnements récifaux antérieures en eau profonde. Apparemment, têtes de corail en bonne santé ont ensuite été identifiés pour l'échantillonnage le long de ce transect bathymétrique, y compris: (1) trois individuel ~ 1 m de diamètre patates de corail de M. annularis, qui étaient tous à 5 m de profondeur d'eau (WD); et (2) trois individuels ~ 1 m de diamètre patates de corail de M. faveolata, qui étaient tous à 12 m WD. Rayonnement photosynthétiquement actif (PAR) a été mesurée comme 33-36% PAR à 5 m WD et 18-22% PAR à 10 m WD. L'échantillonnage a été effectué en Janvier lorsque la SST était de 26 ° C à des profondeurs d'eau de la 5 m et 12 m. Chacun de ces six têtes de corail a été échantillonné en triple exemplaire à des positions spatiales équivalentes (c'est à dire., Environ 45 ° de latitude nord sur chacune des six têtes de corail hémisphériques). Chaque échantillon se composait d'un diamètre de 2,5 cm corail biopsie de tissu-squelette qui a été recueilli avec un coup de poing de la voûte nettoyé. Trois biopsies de tissus-squelette de corail ont été échantillonnés sur la plongée sous-type avec des mains gantées de chacune des têtes de corail (9 de M. annularis colonies à 5 m WD et 9 de M. faveolata à 12 m WD). Immédiatement après la collecte de profondeur, chacune des carottes de biopsie a été placé dans un tube de polypropylene de 50 ml à centrifuger stérile, étanche vis-haut, et est retourné à la surface. L'eau de mer a été décantée à partir de chaque tube de centrifugeuse et chaque biopsie au trocart est ensuite immergé, stocké et transporté dans 4% de paraformaldéhyde.
<p class="Jove_content"> imagerie SBFI a déjà été réalisée sur un large éventail d'échantillons biologiques, y compris l'ensemble du cerveau et tout-cardiaques tissus humains, des embryons de souris intactes, des embryons de poisson zèbre, et plusieurs types d'échantillons d'animaux avec des os intacts 23-30. La plupart de ces études utilisées microscopie optique / lumière soit avec fluorescence ou technique sur le terrain vives. Cependant, des études ont été menées à ultra-forts grossissements utilisant électronique à balayage bloc série visage imagerie dans le passé 31. Dans la présente étude, un protocole de SBFI modifié a été mis au point pour les coraux et appliqué pour la première fois. Parce que M. annularis et M. polypes coralliens faveolata sont 1-2 mm d'épaisseur, aucune des techniques de microscopie optique de routine serait capable de pénétrer toute l'épaisseur du tissu corail de polypes. Par conséquent, nous avons SBFI protocole de préparation des échantillons spécialement conçu pour les échantillons de corail. En outre, nous avons conçu sur mesure un porte-stéréoscopique, Qui est motorisé pour se déplacer dans les deux directions x et y. Cet appareil prend des images de la face du bloc de l'échantillon plutôt que de recueillir les sections à l'aide d'un microtome régulier devant le microscope. Nous avons également introduit une autre à deux photons technique de microscopie optique non linéaire à l'image les mêmes polypes coralliens dans toute l'épaisseur des tissus coralliens. Cette surmonte les limitations imposées par SBFI en termes de décalcification et la possibilité de changements dans la morphologie des tissus et le volume (rétrécissement) pouvant être induites par la préparation des échantillons (déshydratation) et les protocoles de traitement. En outre, les profils d'émission des coraux ont été résolues spectralement à identifier leurs émissions de pointe et les variations entre les chromatophores et les zooxanthelles photosynthétique. Ces résultats ont été évalués dans le contexte de la méthode utilisée et leurs avantages particuliers en ce qui concerne le temps d'acquisition, le temps d'analyse, et la capacité de résoudre des détails fins structurelles sans compromettre la strintégrité uctural du tissu corail.Protocol
Representative Results
Discussion
Recherche sur les récifs de corail est un effort de recherche hautement interdisciplinaire, comprenant l'analyse de la simultanée physiques, chimiques, et des phénomènes biologiques qui opèrent dans le milieu marin. L'étude des écosystèmes de récifs coralliens complexes est donc préférable terminé dans un "Powers of Ten" cadre contextuel (Figure 10). Cette compilation graphique montre que l'écosystème corallien couvre un large éventail de dimensions spatiales (10 <su…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Donna Epps, histologist at Institute for Genomic Biology, University of Illinois Urbana-Champaign (UIUC), for her capable technical assistance in sample preparation and sectioning. This work was supported by a research grant to B.W. Fouke from the Office of Naval Research (N00014-00-1-0609). In addition, C.A.H. Miller received grants from the UIUC Department of Geology Wanless Fellowship, UIUC Department of Geology Leighton fund and UIUC Department of Geology Roscoe Jackson fieldwork fund. Interpretations presented in this manuscript are those of the authors and may not necessarily represent those of the granting institutions. We also thank the Caribbean Research and Management of Biodiversity (Carmabi) laboratory on Curaçao for their support and collaboration in collecting the coral tissue biopsy samples. We thank Claudia Lutz, IGB Media Communication Specialist for her able language correction.
Materials
| Coral Tissue Skeleton | None | None | 2.5 cm Biopsy from natural habitat |
| Arch Punch Coring Device | C.S. Osborne and Company | No. 149 | For Coral biopsy collection |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | RT 15700 | 16% Pre-diluted |
| Histoclear/Safeclear II | Electron Microscopy Sciences | RT 64111-04 | Non-Toxic alternate to Xylene, Dehydration and Deparafinization |
| Xylene and Ethanol | Fisher Scientific | Fisher Scientific | Dehydration |
| Paraffin Wax | Richard Allen Scientific | Type H REF 8338 | Infiltration solution |
| Vybar | The Candle Maker | None | Component of Red Wax |
| Stearin | The Candle Maker | None | Component of Red Wax |
| Sudan IV | Fisher Chemical | S667-25 | Red Wax-Opaque background |
| Wheat Germ Agglutinin (WGA) | Life Technologies | W32466 | For labeling Coral Mucus |
| Prolong Gold | Life Technologies | P36095 | Anti-fade mounting media |
| Fluoro Dish | World Precision Instruments | FD-35-100 | For two-photon imaging |
| XY Motor, Driver and Controller | Lin Engineering | 211-13-01R0, R325, R256-RO | XY Translational Movement |
| Hot Plate | Corning | DC-220 | Melting all wax |
| Convection Oven | Yamato | DX-600 | Infiltration and Embedding |
| Tissue Processor | Leica | ASP 300 | Dehydration, Infiltration |
| Microtome | Leica | RM2055 | Disposable knifes |
| Stereo Microscope | Carl Zeiss | Stereolumar V 12 | 1.5x (30 mm WD) Objective |
| Fluorescence Microscope with ApoTome | Carl Zeiss | Axiovert M 200, ApoTome I System | Imaging thin section of a polyp: Zooxanthellae |
| Axiocam camera | Carl Zeiss | MRm | Monochrome camera 1388×1040 pixels |
| Axiovision Software | Carl Zeiss | Version 4.8 | Image acquisition program |
| Two-Photon Laser | Spectraphysics | Maitai eHP, pulsed laser (70 fs) | With DeepSee module |
| Laser Scanning Microscope | Carl Zeiss | LSM 710 with Spectral Detector | 34 channel PMT detection |
| Zen Software | Carl Zeiss | 2010 or above | for two-photon and spectral image acquisition |
| Imaris Suite Software | Bitplane, Inc., | Version 7.0 or above | 3D Volume, Iso-surface Rendering, Visualization |
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