The neurochemistry of mammalian brain is changed in many neurological and systemic diseases. Characteristic profiles of cerebral metabolites can be efficiently obtained based on crude extracts of brain tissue. To this end, high-resolution NMR spectroscopy is employed, enabling detailed quantitative analysis of metabolite concentrations (metabolomics).
Studies of gene expression on the RNA and protein levels have long been used to explore biological processes underlying disease. More recently, genomics and proteomics have been complemented by comprehensive quantitative analysis of the metabolite pool present in biological systems. This strategy, termed metabolomics, strives to provide a global characterization of the small-molecule complement involved in metabolism. While the genome and the proteome define the tasks cells can perform, the metabolome is part of the actual phenotype. Among the methods currently used in metabolomics, spectroscopic techniques are of special interest because they allow one to simultaneously analyze a large number of metabolites without prior selection for specific biochemical pathways, thus enabling a broad unbiased approach. Here, an optimized experimental protocol for metabolomic analysis by high-resolution NMR spectroscopy is presented, which is the method of choice for efficient quantification of tissue metabolites. Important strengths of this method are (i) the use of crude extracts, without the need to purify the sample and/or separate metabolites; (ii) the intrinsically quantitative nature of NMR, permitting quantitation of all metabolites represented by an NMR spectrum with one reference compound only; and (iii) the nondestructive nature of NMR enabling repeated use of the same sample for multiple measurements. The dynamic range of metabolite concentrations that can be covered is considerable due to the linear response of NMR signals, although metabolites occurring at extremely low concentrations may be difficult to detect. For the least abundant compounds, the highly sensitive mass spectrometry method may be advantageous although this technique requires more intricate sample preparation and quantification procedures than NMR spectroscopy. We present here an NMR protocol adjusted to rat brain analysis; however, the same protocol can be applied to other tissues with minor modifications.
Murine modeller har blitt brukt mye i hjerneforskning en. Genotype-fenotype korrelasjoner har blitt undersøkt i mus og rottehjerner ved å studere genekspresjon ved RNA og / eller proteinnivåer på den ene side, og morfologiske, funksjonelle, elektrofysiologiske og / eller adferdsmessige fenotyper på den andre 2-6. Men for å helt forstå mekanismene som knytter fenotype til genotype, er det viktig å undersøke de molekylære hendelser nedstrøms protein uttrykk, altså. metabolismen av de biokjemiske substrater hvorpå enzymer virker 7. Dette kravet førte i løpet av de siste 10 til 15 år, til en renessanse for metabolsk forskning i mange grener av biologien 8,9. Mens klassiske metabolske studier har ofte vært fokusert på detaljer om bestemte veier, er det nye metabolomic tilnærming rettet mot en altomfattende undersøkelse av den globale metabolske profil av vevet under vurdering.En konsekvens av dette konseptet er et åpenbart behov for analytiske verktøy som minimerer bias mot spesifikke metabolske veier og / eller klasser av forbindelser. Det er imidlertid en klassisk biokjemisk analyse basert på en bestemt kjemisk reaksjon på en bestemt analytt som skal spesifiseres før analysen utføres. I motsetning til dette er spektroskopiske teknikker slik som kjernemagnetisk resonans (NMR) spektroskopi og massespektrometri (MS) (i) basert på bestemte molekylære (fysikalske) egenskaper av biokjemiske forbindelser, som hver gir opphav til en eller flere forskjellige signaler i et spektrum påvises i løpet av et eksperiment; og (ii) påvise et stort antall forskjellige forbindelser per eksperiment.
Således inneholder hvert spektrum den kombinerte informasjon fra en rekke metabolitter. Av denne grunn, spektroskopiske metoder er tilstrekkelig verktøy for metabolomikk, da ingen tidligere valg som må gjøres med hensyn til arten av den analytt som skal måles 8 </sup>. Som en konsekvens av disse teknikkene naturligvis egner seg til forsøksstudier, fordi de i stor grad forenkle deteksjon av uventede metabolske endringer.
Selv om NMR-spektroskopi og MS kan brukes om hverandre for analyse av mange metabolitter, besitter hver metode spesifikke fordeler og ulemper som nylig har blitt anmeldt 10. Kort, kan NMR-spektroskopi som regel utføres fra rå ekstrakter og krever ikke kromatografisk separasjon av eksempelforbindelser før analyse. I motsetning til dette, virker MS med gass eller væske-kromatografi (GC eller LC) separasjon, med unntak av bestemte nylige utviklinger som massespektrometri avbildning. I noen spesielle tilfeller slik som analyse av sukkerarter, kan LC-separasjon blitt en nødvendighet for NMR-spektroskopi, i tillegg, fordi resonans linjer av forskjellige sukkere overlappe betydelig i proton (1H)-NMR-spektra. Ikke desto mindre, 1H NMR-spektroskopi uten chromatographic separasjon er fortsatt det mest populære, nesten universelt anvendt metabolomic NMR-metoden. Vanligvis er prøvepreparering mer tidkrevende og komplisert for MS enn for NMR-spektroskopi. Alvorlige problemer på grunn av matrix effekter er mye mindre vanlig i NMR-spektroskopi enn i MS der de kan føre til betydelig svekkede signaler. Metabolitt kvantifisering kan oppnås ved en av metodene. Imidlertid er flere vanlige forbindelser som er nødvendig for MS på grunn av variasjoner i matrise effekter og ionisering effektivitet mellom metabolitter. I motsetning til dette, er det kun én standard per prøve nødvendig for en NMR-spektroskopisk analyse fordi under egnede måleforhold, er den sistnevnte metode egen kvantitative takket være strengt lineær NMR respons ved de observerte kjerner. En stor ulempe med NMR er dens relativt lav følsomhet. MS, spesielt LC-MS, er mer følsom enn NMR av flere størrelsesordener; på grunn av dette, er MS å foretrekke fremfor NMR foranalyse av forbindelser som forekommer i meget lave konsentrasjoner. På den annen side er den ikke-destruktiv naturen av NMR-eksperimentet en klar fordel i forhold til MS; på denne måten, kan NMR utføres gjentatte ganger på den samme prøve, for eksempel for forskjellige NMR-aktive kjerner som for eksempel 1H, fosfor-31 (31 P), karbon-13 (13 C), fluor-19 (19 F) el. da ingen vesentlige er forbrukt ved hjelp av NMR i motsetning til MS-målinger.
Både NMR og MS kan anvendes i forskjellige modi, hver av dem å være optimal for påvisning av forbindelser med bestemte kjemiske karakteristika. For eksempel er 31 P NMR ofte bedre egnet enn 1 H NMR for analyse av moderat konsentrerte fosforylerte forbindelser, selv om nesten alt fosforylerte metabolitter også inneholder protoner. Imidlertid kan deres 1 H NMR-signaler være skjult av en H NMR-signaler fra andre, ikke-fosforylerte forbindelser, mens den sistnevnteselvsagt ikke forårsake bakgrunnssignaler på 31 P-NMR-spektra. I en analog situasjon, er 19 C NMR-analyse å være foretrukket for fluorholdige forbindelser, f.eks, fluorholdige midler (ingen bakgrunnssignaler fra endogene metabolitter), mens det spesielle tilfelle av 13C NMR er av interesse nesten utelukkende dersom skjebnen til 13 C- merkede eksogene metabolske forløpere må følges, på grunn av den ekstremt lave naturlige overflod av 13 C isotop (ca. 1%). Mange massespektrometre jobbe i enten negativ ion-modus eller positiv ion modus. Derfor er det viktig å vite forut for analysen enten ionene som skal overholdes er negativt eller positivt ladet. Vi fokus her på en protokoll for analyse av hjernevevet metabolomet ved 1H og 31 P-NMR-spektroskopi, fordi denne metode gir et stort antall viktige metabolittkonsentrasjoner til lave kostnader i form av (i) tiden som er nødvendig for prøvepreparering ennd (ii) innsats som kreves for metabolitten kvantifisering. Alle eksperimenter kan utføres ved hjelp av utstyret av en standard våt-kjemi laboratorium og en høy oppløsning NMR-spektroskopi anlegget. Ytterligere krav er beskrevet i protokollen nedenfor.
NMR-spektroskopi er en effektiv metode for å måle konsentrasjoner av kjemiske forbindelser i oppløsning i et meget reproduserbar og nøyaktig måte. Imidlertid, for å oppnå høy kvalitet av data er det nødvendig å overholde visse regler for prøvepreparering og analyse. Etter bestemmelse av metabolittkonsentrasjoner ved NMR-spektroskopi, hverken generering eller mottak av NMR-signalet dominerer kvantifisering feilen, dersom intensiteten av en observert signal nærmer deteksjonsterskel (spesielt svakt signal). I a…
The authors have nothing to disclose.
Support by Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS, UMR 6612 and 7339) is gratefully acknowledged.
Isoflurane | Virbac | Vetflurane | Anesthetic for animals |
Isoflurane vaporizer | Ohmeda | Isotec 3 | Newer model available: Isotec 4 |
Scalpel, scissors, forceps, clamps | Harvard Apparatus Fisher Scientific |
various various |
Surgical equipment for animals |
Freeze-clamp tool | homebuilt | n/a | Tong with aluminium plates, to be inserted in liquid nitrogen for cooling |
Dewar | Nalgene | 4150-4000 | |
Liquid nitrogen | Air Liquide | n/a | |
Nitrogen gas | Air Liquide | n/a | |
Nitrogen evaporator | Organomation Associates | N-EVAP 111 | Can be replaced by homebuilt device |
Mortar | Sigma-Aldrich | Z247472 | |
Pestle | Sigma-Aldrich | Z247510 | |
Tissue homogenizer | Kinematica | Polytron | With test tubes fitting homogenizer shaft |
Electronic scale | Sartorius | n/a | |
Methanol | Sigma-Aldrich | M3641 | |
Chloroform | Sigma-Aldrich | 366910 | |
Glass centrifuge tubes | Kimble | 45500-15, 45500-30 | Kimax 15-mL, 30-mL tube |
Microcentrifuge tubes | Kimble | 45150-2 | Kimax 2-mL tube; should replace "Eppen-dorf" tube if compatible with centrifuge rotor |
polystyrene pipettes | Costar Corning | Stripettes | 5 and 10-mL volumes |
Deuterochloroform | Sigma-Aldrich | 431915 | 99.96 % deuterated |
Deuterium oxide | Sigma-Aldrich | 423459 | 99.96 % deuterated |
Deuterium chloride | Alpha Aesar | 42406 | 20 % in deuterium oxide |
Sodium deuteroxide | Sigma-Aldrich | 164488 | 30 % in deuterium oxide |
Lyophilizer | Christ | Alpha 1-2 | |
Cold centrifuge | Heraeus | Megafuge 16R | |
pH meter | Eutech Cybernetics | Cyberscan | |
CDTA | Sigma-Aldrich | D0922 | |
Cesium hydroxide | Sigma-Aldrich | 516988 | |
NMR tubes | Wilmad | 528-PP | |
NMR stem coaxial insert | Sigma-Aldrich | Z278513 | By Wilmad |
NMR pipettes | Sigma-Aldrich | Z255688 | |
Pipettes | Eppendorf | 연구 | With tips for volumes from 0.5 to 1000 μL |
Pipet-Aid | Drummond | XP | |
NMR spectrometer | Bruker | AVANCE 400 | including probe and other accessories |
NMR software | Bruker | TopSpin 1.3 | newer version available: Topspin 3.2 |
Water-soluble standard compounds | Sigma-Aldrich | various | |
Phospholipid standard compounds | Avanti Polar Lipids Doosan Serdary Sigma-Aldrich |
various various various |
Source for plasmalogens, but may be < 70 – 80 % purity |
Methylenediphosphonate | Sigma-Aldrich | M9508 | |
TSP-d4 | Sigma-Aldrich | 269913 |