Metabolomic Analys av råtthjärna genom högupplöst NMR-spektroskopi av vävnadsextrakt

Summary

The neurochemistry of mammalian brain is changed in many neurological and systemic diseases. Characteristic profiles of cerebral metabolites can be efficiently obtained based on crude extracts of brain tissue. To this end, high-resolution NMR spectroscopy is employed, enabling detailed quantitative analysis of metabolite concentrations (metabolomics).

Abstract

Studies of gene expression on the RNA and protein levels have long been used to explore biological processes underlying disease. More recently, genomics and proteomics have been complemented by comprehensive quantitative analysis of the metabolite pool present in biological systems. This strategy, termed metabolomics, strives to provide a global characterization of the small-molecule complement involved in metabolism. While the genome and the proteome define the tasks cells can perform, the metabolome is part of the actual phenotype. Among the methods currently used in metabolomics, spectroscopic techniques are of special interest because they allow one to simultaneously analyze a large number of metabolites without prior selection for specific biochemical pathways, thus enabling a broad unbiased approach. Here, an optimized experimental protocol for metabolomic analysis by high-resolution NMR spectroscopy is presented, which is the method of choice for efficient quantification of tissue metabolites. Important strengths of this method are (i) the use of crude extracts, without the need to purify the sample and/or separate metabolites; (ii) the intrinsically quantitative nature of NMR, permitting quantitation of all metabolites represented by an NMR spectrum with one reference compound only; and (iii) the nondestructive nature of NMR enabling repeated use of the same sample for multiple measurements. The dynamic range of metabolite concentrations that can be covered is considerable due to the linear response of NMR signals, although metabolites occurring at extremely low concentrations may be difficult to detect. For the least abundant compounds, the highly sensitive mass spectrometry method may be advantageous although this technique requires more intricate sample preparation and quantification procedures than NMR spectroscopy. We present here an NMR protocol adjusted to rat brain analysis; however, the same protocol can be applied to other tissues with minor modifications.

Introduction

Murina modeller har använts i stor utsträckning i hjärnforskning ^1. Genotyp-fenotyp korrelationer har undersökts i mus och råtta hjärnor genom att studera genuttryck på RNA och / eller proteinnivåer, å ena sidan, och morfologiska, funktionella, elektrofysiologiska och / eller beteende fenotyper på den andra ^2-6. Men att helt förstå de mekanismer som kopplar fenotyp till genotyp, är det absolut nödvändigt att undersöka de molekylära händelser nedströms av proteinuttryck, dvs. metabolismen av de biokemiska substrat på vilka enzymer verkar ^7. Detta krav ledde, under de senaste 10 till 15 åren, till en renässans för metabolisk forskning inom många grenar av biologin ^8,9. Medan klassiska metaboliska studier har ofta fokuserat på detaljer i specifika vägar, är den nya metabolomic metod som är inriktad mot en allomfattande undersökning av den globala metabola profilen av vävnaden i fråga.En konsekvens av detta koncept är ett uppenbart behov av analytiska verktyg som minimerar inriktning mot specifika metaboliska vägar och / eller klasser av föreningar. Emellertid är en klassisk biokemisk analys baserad på en särskild kemisk reaktion av en specifik analyt som behöver specificeras innan analysen utförs. Däremot är spektroskopiska tekniker såsom kärnmagnetisk resonans (NMR)-spektroskopi och masspektrometri (MS) (i) baserat på särskilda molekylära (fysiska) egenskaper hos biokemiska föreningar, som vardera ger upphov till ett eller flera distinkta signaler i ett spektrum detekteras under loppet av ett försök; och (ii) detektera ett stort antal olika föreningar per försök.

Således varje spektrum innehåller det kombinerade information av en hel rad av metaboliter. Därför spektroskopiska metoder är lämpliga verktyg för metabolomik, eftersom ingen tidigare val måste göras när det gäller typen av analyten som skall mätas ⁸ </sup>. Som en följd av dessa tekniker lämpar naturligtvis sig för förberedande studier, eftersom de i hög grad underlätta upptäckten av oväntade metabola förändringar.

Även om NMR-spektroskopi och MS kan användas omväxlande för analys av många metaboliter, varje metod besitter specifika fördelar och nackdelar som nyligen har granskats ^10. I korthet kan NMR-spektroskopi vanligtvis utföras från råextrakt och inte kräver kromatografisk separation av provföreningar före analysen. Däremot MS fungerar med gas eller vätskekromatografi (GC eller LC) separation, förutom för särskilda senaste utvecklingen såsom masspektrometri avbildning. I ett fåtal speciella fall, t.ex. analys av socker, kan LC separationen blivit en nödvändighet för NMR-spektroskopi också, eftersom resonanslinjer olika sockerarter överlappar kraftigt i proton ^(1H) NMR-spektra. Icke desto mindre, ^ett 'H NMR-spektroskopi utan chromatographic separation fortfarande den mest populära, nästan universellt tillämpad metabolomic NMR-metoden. Generellt är provberedningen mer tidskrävande och komplex för MS än för NMR-spektroskopi. Allvarliga problem på grund av matriseffekter är mycket mindre vanliga i NMR-spektroskopi än i MS där de kan leda till kraftigt försvagade signaler. Metabolit kvantifiering kan uppnås med endera metoden. Emellertid är flera standardföreningar behövs för MS beror på variationer i matriseffekter och jonisering effektivitets mellan metaboliter. Däremot har endast en standard per prov som behövs för en NMR-spektroskopisk analys på grund under lämpliga förhållanden mätning, är den senare metoden i sig kvantitativa tack vare strikt linjär NMR svar från de observerade kärnor. En stor nackdel med NMR är dess relativt låg känslighet. MS, särskilt LC-MS, är känsligare än NMR med flera storleksordningar; av denna anledning, är MS att föredra framför NMR föranalys av föreningar som förekommer vid mycket låga koncentrationer. Å andra sidan, är den icke-förstörande karaktär NMR experiment en klar fördel över MS; på detta sätt, kan NMR utföras upprepade gånger på samma prov, t.ex. för olika NMR-aktiva kärnor såsom ^1H, fosfor-31 ⁽³¹ P), kol-13 ^(13C), fluor-19 ⁽¹⁹ K) osv. eftersom inget material förbrukas genom NMR i motsats till MS-mätningar.

Både NMR och MS kan användas i olika lägen, var och en att vara optimal för detektion av föreningar med särskilda kemiska egenskaper. Till exempel är ³¹ P NMR ofta bättre lämpade än ^1H NMR för analys av måttligt koncentrerade fosforylerade föreningar, även om nästan alla fosforylerade metaboliter innehåller också protoner. Emellertid kan deras ¹ H NMR signaler skymmas av ^ett H-NMR-signaler från andra, icke-fosforylerade föreningar, medan den senareuppenbarligen inte orsakar bakgrundssignaler i ³¹ P NMR-spektra. I en analog situation är ^19F NMR-analys att föredra för fluorföreningar, t.ex., fluorerade läkemedel (inga bakgrundssignaler från endogena metaboliter), medan det speciella fallet med ^13C NMR är av intresse nästan uteslutande om ödet för ¹³ C märkta exogena metaboliska prekursorer måste följas, på grund av den extremt låga naturliga överflödet av ^13C isotopen (ca 1%). Många masspektrometrar arbetar i antingen negativ jon-läge eller positiv jon-läge. Därför är det viktigt att veta i förväg av analysen om de joner som skall observeras är negativt eller positivt laddade. Vi fokuserar här på ett protokoll för analys av hjärnvävnaden Metabolome med ^1H och ³¹ P NMR-spektroskopi, eftersom denna metod ger ett stort antal viktiga metabolitkoncentrationer till låg kostnad i form av (i) tid som behövs för provberedning and (ii) ansträngning som krävs för metabolit kvantifiering. Alla experiment kan genomföras med användning av utrustning av en standard våt-kemilaboratorium och en högupplösande NMR-spektroskopi anläggning. Ytterligare krav beskrivs i protokollet nedan.

Protocol

OBS: Djuretik UTTALANDE Djurstudier på råttor följde de riktlinjer som gäller i Frankrike, och har godkänts av den lokala etiska kommittén (# 40.04, Högskolan i Aix-Marseille Medical School, Marseille, Frankrike). 1 Skörd och Frysråtthjärna Förbered artiklar krävs: flytande kväve (N 2liq.) I Dewar som är tillräckligt stor för att hålla en frysklämma (minst 2-3 L volym); bedövningsmedel (t.ex. isofluran eller ketamin / xylazin); anestes…

Representative Results

För att få bästa upplösning i metabolisk NMR-spektra för hjärnan och andra vävnadsextrakten, har det länge varit vanligt att ta bort eller mask metalljoner (viktigast: paramagnetiska joner) som finns i extraktlösningar. Detta har uppnåtts antingen genom att tillsätta ett kelateringsmedel, såsom EDTA eller CDTA till extraktet 19, eller genom att passera extraktet genom ett jonbytarharts såsom Chelex-100 20. Resultaten som presenteras i Figur 1 visar att detta steg är i…

Discussion

NMR-spektroskopi är en effektiv metod för mätning av koncentrationer av kemiska föreningar i lösning i ett mycket reproducerbart och noggrant sätt. Men är det nödvändigt att hålla sig till vissa regler som gäller beredning och analys prov för att erhålla uppgifter av hög kvalitet. Vid bestämning av koncentration av metaboliter genom NMR-spektroskopi, varken generering eller mottagning av den NMR-signal dominerar kvantifiering fel såvida intensiteten av en observerad signal närmar sig tröskeln detekteri…

Materials

Isoflurane	Virbac	Vetflurane	Anesthetic for animals
Isoflurane vaporizer	Ohmeda	Isotec 3	Newer model available: Isotec 4
Scalpel, scissors, forceps, clamps	Harvard Apparatus Fisher Scientific	various various	Surgical equipment for animals
Freeze-clamp tool	homebuilt	n/a	Tong with aluminium plates, to be inserted in liquid nitrogen for cooling
Dewar	Nalgene	4150-4000
Liquid nitrogen	Air Liquide	n/a
Nitrogen gas	Air Liquide	n/a
Nitrogen evaporator	Organomation Associates	N-EVAP 111	Can be replaced by homebuilt device
Mortar	Sigma-Aldrich	Z247472
Pestle	Sigma-Aldrich	Z247510
Tissue homogenizer	Kinematica	Polytron	With test tubes fitting homogenizer shaft
Electronic scale	Sartorius	n/a
Methanol	Sigma-Aldrich	M3641
Chloroform	Sigma-Aldrich	366910
Glass centrifuge tubes	Kimble	45500-15, 45500-30	Kimax 15-mL, 30-mL tube
Microcentrifuge tubes	Kimble	45150-2	Kimax 2-mL tube; should replace "Eppen-dorf" tube if compatible with centrifuge rotor
polystyrene pipettes	Costar Corning	Stripettes	5 and 10-mL volumes
Deuterochloroform	Sigma-Aldrich	431915	99.96 % deuterated
Deuterium oxide	Sigma-Aldrich	423459	99.96 % deuterated
Deuterium chloride	Alpha Aesar	42406	20 % in deuterium oxide
Sodium deuteroxide	Sigma-Aldrich	164488	30 % in deuterium oxide
Lyophilizer	Christ	Alpha 1-2
Cold centrifuge	Heraeus	Megafuge 16R
pH meter	Eutech Cybernetics	Cyberscan
CDTA	Sigma-Aldrich	D0922
Cesium hydroxide	Sigma-Aldrich	516988
NMR tubes	Wilmad	528-PP
NMR stem coaxial insert	Sigma-Aldrich	Z278513	By Wilmad
NMR pipettes	Sigma-Aldrich	Z255688
Pipettes	Eppendorf	연구	With tips for volumes from 0.5 to 1000 μL
Pipet-Aid	Drummond	XP
NMR spectrometer	Bruker	AVANCE 400	including probe and other accessories
NMR software	Bruker	TopSpin 1.3	newer version available: Topspin 3.2
Water-soluble standard compounds	Sigma-Aldrich	various
Phospholipid standard compounds	Avanti Polar Lipids Doosan Serdary Sigma-Aldrich	various various various	Source for plasmalogens, but may be < 70 – 80 % purity
Methylenediphosphonate	Sigma-Aldrich	M9508
TSP-d4	Sigma-Aldrich	269913