В естественных изображений из Dauer конкретным нейронов ремоделирования в C. Элеганс

Summary

Following exposure to specific environmental stressors, the nematode Caenorhabditis elegans undergoes extensive phenotypic plasticity to enter into a stress-resistant ‘dauer’ juvenile stage. We present methods for the controlled induction and imaging of neuroplasticity during dauer.

Abstract

Механизмы, контролирующие вызванное стрессом фенотипическую пластичность у животных часто сложным и трудным для изучения в естественных условиях. Классическим примером индуцированной стрессом пластичности является этап Dauer из C. Элеганс. Dauers являются альтернативой развития личиночной стадии формируются в условиях низких концентраций бактериальной пищи и высоких концентраций DauER феромона. Dauers отображения обширный развития и поведения пластичность. Например, набор из четырех внутренний-губной квадранте (IL2Q) нейроны претерпевают обратимое обширную реконструкцию в процессе формирования DauER. Используя известную запись экологические тропы регулирования DauER, ранее установленного способа для производства сырой DauER феромона от крупномасштабных жидкость нематод культур демонстрируется. С помощью этого метода, концентрации 50000 – 75000 нематоды / мл жидкой культуры является достаточным для получения высокой активностью сырой DauER феромон. Сырой феромон потенция Determined по биоанализе доза-реакция. Наконец, методы, используемые для в естественных условиях покадровой съемки из IL2Qs при формировании DauER описаны.

Introduction

Фенотипический пластичность, в том числе развития и состояния психического пластичности, имеет важное значение для адаптации к неблагоприятным условиям окружающей среды и считается движущей силой в эволюции ^1. C. Элеганс является модельным организмом часто используются для исследований в области развития и нейробиологии. В идеальных условиях, C. Элеганс развивается через четыре личиночной стадии перед входом в репродуктивной стадии взрослого. Тем не менее, в условиях низкой доступности пищи и высокой плотностью населения, C. Элеганс могут пройти переключатель с развитием и войти в долгоживущих и стресс-устойчивых этапе DauER ^2. Dauers отображать несколько морфологических и поведенческих отличий от не-dauers что, вероятно, опосредующие этот стрессоустойчивость. Экологические сигналы и генетические пути, регулирующие въезд DauER широко описаны ^{3, 4, 5, 6, 7.} Однако молекулярные механизмы, контролирующие отдельные изменения фенотипических которые происходят Dформирование рительными Dauer менее понятны.

Изучение DauER конкретных фенотипов требует производства DauER животных. Это может быть достигнуто тремя способами: 1) Выбор из голодали культуры C. Элеганс, 2) Использование образования DauER конститутивный (DAF-с) мутантов, 3) индукции формирования DauER через очищенной феромона. Это довольно просто подобрать dauers от стандартного NGM пластины с C. население Элеганс, которая исчерпала свой ​​бактериальный продовольственную. В наших руках, стандартный NGM пластины первоначально высевают с 50 мкл OP50 кишечной палочки, могут расти в течение 3 дней, а затем, привитых 3 – 4 взрослых гермафродитов выдерживали при 25 ° С исчерпает поставку продовольствия в течение одной недели и производить несколько тысяч dauers пределах дополнительных 3 дней (в дополнение к многочисленным голода не-dauers). Тем не менее, этот способ является неудовлетворительным для анализа процессов, происходящих во время линьки в DАуэр. Трудно определить, какой из нескольких тысяч животных на типичного голодали пластины вступаем в Dauer. Кроме того, использование голодали пластины не дает возможность синхронизации. Использование DAF-с-мутантов позволяет синхронизации и надежной генерации dauers. Тем не менее, нет никакой гарантии, что конкретный DAF-C мутации не влияют на другие DauER конкретного фенотипа отдельно или в сочетании с дополнительными мутаций.

Наличие DauER феромона впервые подразумевается Cassada и Рассела и позже показали Золотой и Риддл. Dauer феромона с тех пор были химически охарактеризован ^{2, 8, 9, 10.} Очищенный феромона состоит из сложной смеси ascarosides, которые в различных формах регулировать как поведенческие и развития процессов ^{9, 11.} Использование сырой экстракт DauER феромонов позволяет надежно контролируется индукция синхронизированных dauers в фоновом режиме дикого типа. </р>

Нервная система и связанные глиальные клетки подвергаются ремоделирования во DauER личинки образования ^{12, 13, 14.} Некоторые из этих изменений являются необратимыми, таких как ремоделирования глиальные клетки во время Dauer ^{13, 14.} Тем не менее другие ремоделирования события обратимы после возвращения к благоприятным экологические условия. Например, набор из четырех IL2Q нейронов подвергаются быстрому и обратимое нейронов ремоделирования при формировании DauER включая: дендритов разветвление, перехода от одного дендритных к multidendritic нейроны и аксоны реконструкции ^12. Здесь методы позволяют для надежной визуализации в естественных условиях стресс-индуцированной нейропластичностью в качестве модельного организма. Методы, представленные для производства и тестирования сырой DauER феромона предварительно описано и составлена ​​из нескольких источников ^{4, 8, 15, 16, 17, 18.}

Protocol

1 Сырая Dauer Феромоны Производство Вырастить OP50 Е. палочки из одной колонии O / N при 37 ° С при встряхивании в 100 мл LB бульоне при 200 оборотах в минуту. Примечание: Эта O / N. культуры могут быть сделаны заранее и хранили при 4 ° С. Вырастить N2 C. Элеганс на 15 – 20 6 см чашки Петри с …

Representative Results

Производство результатов сырой Dauer феромонных в желтой жидкости (рисунок 1), что является одновременно тепло и холод стабильной. Аликвоты сырого феромона хранятся при температуре от -20 ° С до бесконечности без очевидного потери активности. После производства феромона, один био…

Discussion

Экспертиза DauER конкретных нейропластичностью и других DauER связанных морфологических изменений требует контролируется и надежный формирование dauers либо с помощью генной мутации (т.е., DAF-с-мутантов) или воздействия животных дикого типа к феромона. В то время как использование генети…

Materials

N2 C. elegans Bristol strain	Caenorhabditis Genetics Center
PT2660 myIs13[Pklp-6::gfp] III	Upon request from Schroeder lab
PT2762 myIs14[Pklp-6::gfp] V	Upon request from Schroeder lab
JK2868 qIs56[Plag-2::gfp] V	Caenorhabditis Genetics Center
OP50 E. coli	Caenorhabditis Genetics Center
Petri dishes	Tritech Research	60 mm T3308, 35 mm T3501
NGM agar	Various		3 g NaCl, 17 g agar, 2.5 g peptone in 975 mL H2O autoclaved cooled to 55°C followed by 1 mL of 5 mg/ml cholesterol in ethanol, 25 mL of 1 M KPO4 buffer (pH 6.0), 1 mL of 1 M CaCl2, 1 mL of 1 M MgSO4
S Media	Various		S media consists of S basal solution (1.46 g NaCl, 0.25g K2HPO4, 1.5 g KH2PO4, 0.25 ml of 5 mg/ml cholesterol in ethanol and H2O to 250 mL. Autoclaved.) To the S basal solution add 2.5 mL of potassium citrate pH 6.0 (2 g citric acid monohydrate, 29.4 g tri-potassium citrate monohydrate, H2O to 100 mL, autoclaved), 2.5 mL of Trace Metals Solution (1.86 g disodium EDTA, 0.69 g FeSO4 •7 H2O, 0.2 g MnCl2•4 H2O, 0.29 g ZnSO4 •7 H2O, 0.025 g CuSO4 •5 H2O, H2O to 1 liter. Autoclaved and stored in the dark), 0.75 mL of 1 M CaCl2, and 0.75 mL of 1 M MgSO4.
Dauer pheromone plates for dose-response assay	Various		Mix 0.085 g Noble agar, 0.5 mL of 0.513 M NaCl and 5 µL of 5 mg/ml cholesterol dissolved in ethanol in each of 6x 15 mL culture tubes. Add sufficient crude pheromone to each tube to create a range of concentrations. Add H2O to bring the volume to 4.725 mL.  Boil over a Bunsen burner until the agar is dissolved and then cool to 55 °C. Add 125 µL 1 M KPO4 buffer (pH 6.0), 50 µl 0.1 M CaCl2, 50 µL 0.1 M MgSO4 and 50 µl of 5 mg/ml streptomycin sulfate to each tube.  Pour the contents of each tube into a 35 mm diameter Petri dish. Let the agar solidify at room temperature overnight (if longer, store in enclosed container to prevent excessive drying).
Microsphere beads 0.1 micron	Polysciences Inc.	00876-15
M9 buffer	Various		Mix 3 g KH2PO4, 6 g Na2HPO4, 5 g NaCl, 1 ml 1 M MgSO4, H2O to 1 liter. Sterilize by autoclaving