في فيفو التصوير من داور محددة العصبية في إعادة عرض C. ايليجانس

Summary

Following exposure to specific environmental stressors, the nematode Caenorhabditis elegans undergoes extensive phenotypic plasticity to enter into a stress-resistant ‘dauer’ juvenile stage. We present methods for the controlled induction and imaging of neuroplasticity during dauer.

Abstract

آليات السيطرة على الإجهاد الناجم عن المظهرية اللدونة في الحيوانات كثيرا ما تكون معقدة وصعبة للدراسة في الجسم الحي. والمثال الكلاسيكي من التوتر الناجم اللدونة هي المرحلة داور من C. ايليجانس. Dauers هي مرحلة اليرقات التنموية البديلة تشكلت في ظل ظروف تركيزات منخفضة من المواد الغذائية البكتيرية وتركيزات عالية من فرمون داور. عرض Dauers اللدونة التنموية والسلوكية واسعة النطاق. على سبيل المثال، مجموعة من أربعة رباعي الداخلية-شفوي (IL2Q) الخلايا العصبية تخضع لإعادة عكسها واسعة خلال تشكيل داور. الاستفادة من دخول مسارات بيئية تنظيم داور معروفة، وهي طريقة المحددة سابقا لإنتاج النفط الخام داور من فرمون على نطاق واسع الثقافات الخيطية السائلة ويتجلى. مع هذا الأسلوب، وهو تركيز 50،000 – 75،000 الديدان الخيطية / مل من ثقافة السائل كافية لإنتاج قوية للغاية داور الخام فرمون. رجولية فرمون الخام هي DETErmined من قبل الأحيائي الاستجابة للجرعة. وأخيرا، يتم وصف الأساليب المستخدمة لفي الجسم الحي الوقت الفاصل بين التصوير من خلال تشكيل IL2Qs داور.

Introduction

اللدونة المظهري، بما في ذلك اللدونة التنموية والسلوكية، مهم لعمليات التكيف مع الظروف البيئية المعاكسة وتعتبر قوة دافعة في التطور ^1. C. ايليجانس هو كائن نموذج كثيرا ما تستخدم للدراسات في التنمية وبيولوجيا الأعصاب. في ظل ظروف مثالية، C. ايليجانس يتطور من خلال أربع مراحل اليرقات قبل دخول المرحلة الإنجابية الكبار. ومع ذلك، في ظل ظروف انخفاض توافر الغذاء والكثافة السكانية العالية، C. ايليجانس يمكن أن يخضع لعملية التحول التنموي والدخول في معمرة ومقاومة للإجهاد مرحلة داور ^2. عرض Dauers العديد من الاختلافات الشكلية والسلوكية من غير dauers، والتي من المرجح توسط هذه المقاومة الإجهاد. كانت العظة البيئية والوراثية التي تنظم مسارات دخول داور وصف على نطاق واسع ^{3، 4، 5، 6، 7،} إلا أن الآليات الجزيئية التي تتحكم في التغيرات المظهرية الفردية التي تحدث دأقل مفهومة جيدا تشكيل داور خلال شهر.

دراسة الظواهر داور محددة يتطلب إنتاج الحيوانات داور. ويمكن تحقيق ذلك من خلال ثلاث طرق: 1) اختيار من ثقافة محرومة من C. ايليجانس، 2) استخدام داور تشكيل التأسيسية (داف ج) المسوخ، 3) تحريض تشكيل داور من خلال فرمون تنقيته. أنها بسيطة نسبيا لاختيار dauers من لوحة NGM القياسية مع C. السكان ايليجانس أن استنفد البكتيرية الإمدادات الغذائية لها. في أيدينا، وهي لوحة NGM القياسية المصنفة أصلا مع 50 ميكرولتر من OP50 القولونية، سمح لتنمو لمدة 3 أيام، وبعد ذلك تلقيح مع 3 – 4 المنحرفين الكبار أبقى عند 25 درجة مئوية واستنفاد الإمدادات الغذائية في غضون أسبوع وإنتاج عدة آلاف dauers في غضون 3 أيام إضافية (بالإضافة إلى العديد من تجويع غير dauers). ومع ذلك، وهذه الطريقة غير مرضية لعمليات فحص تحدث أثناء تساقط في دأوير. فإنه من الصعب تحديد أي من عدة آلاف من الحيوانات على لوحة تجويع نموذجية ندخل داور. وعلاوة على ذلك استخدام لوحة تجويع، لا يقدم أي إمكانية للتزامن. استخدام داف ج المسوخ يسمح لمزامنة والجيل موثوق بها من dauers. ومع ذلك، ليس هناك ما يضمن أن سوف معينة داف ج طفرة لا تؤثر الظواهر الأخرى داور الخاصة وحدها أو بالاشتراك مع الطفرات إضافية.

وقد ضمنا وجود فرمون داور أول من Cassada وراسل وأظهرت في وقت لاحق من قبل الذهبي وريدل. فرمون داور منذ ذلك الحين اتسمت كيميائيا ^{2، 8، 9، 10.} يتكون فرمون تنقيته من مزيج معقد من ascarosides، التي تنظم في أشكال مختلفة سواء العمليات السلوكية والتنموية ^{9 و 11.} استخدام استخراج فرمون داور الخام يسمح لل الحث موثوق رقابة من dauers متزامنة في الخلفية من النوع البري. </P>

الجهاز العصبي والخلايا الدبقية المرتبطة الخضوع لإعادة تشكيل داور خلال ^{12 و 13 و 14} يرقة. بعض هذه التغيرات لا رجعة فيها، مثل إعادة الخلايا الدبقية خلال داور ^{13 و 14،} ولكن غيرها من الأحداث هي إعادة عرض عكسها على العودة إلى مواتية الظروف البيئية. على سبيل المثال، مجموعة من أربعة الخلايا العصبية IL2Q الخضوع لإعادة الخلايا العصبية السريع وعكسها خلال تشكيل داور بما في ذلك: تشجر تغصناته، والتحول من واحد إلى شجيري الخلايا العصبية محوار multidendritic وإعادة ^12. الطرق تسمح هذه الوثيقة لموثوق التصوير في الجسم الحي من التوتر الناجم المرونة العصبية في كائن نموذج. الأساليب المقدمة للإنتاج واختبار داور فرمون الخام موصوفة سابقا وتجميعها من عدة مصادر ^{4، 8، 15، 16، 17، 18.}

Protocol

1. الخام داور إنتاج فرمون تنمو OP50 E. القولونية من مستعمرة يا واحد / N عند 37 درجة مئوية في حين تهتز في 100 مل من مرق LB عند 200 دورة في الدقيقة. ملاحظة: يمكن إجراء هذا O / N ثقافة مسبقا وتخزينها في 4 درجات مئوية. <li style=";text-align:r…

Representative Results

إنتاج النفط الخام النتائج داور فرمون في السائل الأصفر (الشكل 1) في آن معا الحرارة ومستقرة البارد. يتم تخزين aliquots من فرمون الخام عند -20 درجة مئوية إلى أجل غير مسمى دون أي خسارة واضحة في النشاط. بعد إنتاج فرمون، واحد الأحيائي الاستجابة للجرعة كافية لتقدير تقريبي…

Discussion

دراسة المرونة العصبية داور محددة وغيرها من التغيرات المورفولوجية المرتبطة داور يتطلب التحكم وتشكيل موثوق بها من dauers إما عن طريق طفرة جينية (أي داف المسوخ ج) أو عن طريق التعرض البرية من نوع الحيوانات لفرمون. في حين أن استخدام طفرة جينية للحث dauers مريحة، قد ارب…

Materials

N2 C. elegans Bristol strain	Caenorhabditis Genetics Center
PT2660 myIs13[Pklp-6::gfp] III	Upon request from Schroeder lab
PT2762 myIs14[Pklp-6::gfp] V	Upon request from Schroeder lab
JK2868 qIs56[Plag-2::gfp] V	Caenorhabditis Genetics Center
OP50 E. coli	Caenorhabditis Genetics Center
Petri dishes	Tritech Research	60 mm T3308, 35 mm T3501
NGM agar	Various		3 g NaCl, 17 g agar, 2.5 g peptone in 975 mL H2O autoclaved cooled to 55°C followed by 1 mL of 5 mg/ml cholesterol in ethanol, 25 mL of 1 M KPO4 buffer (pH 6.0), 1 mL of 1 M CaCl2, 1 mL of 1 M MgSO4
S Media	Various		S media consists of S basal solution (1.46 g NaCl, 0.25g K2HPO4, 1.5 g KH2PO4, 0.25 ml of 5 mg/ml cholesterol in ethanol and H2O to 250 mL. Autoclaved.) To the S basal solution add 2.5 mL of potassium citrate pH 6.0 (2 g citric acid monohydrate, 29.4 g tri-potassium citrate monohydrate, H2O to 100 mL, autoclaved), 2.5 mL of Trace Metals Solution (1.86 g disodium EDTA, 0.69 g FeSO4 •7 H2O, 0.2 g MnCl2•4 H2O, 0.29 g ZnSO4 •7 H2O, 0.025 g CuSO4 •5 H2O, H2O to 1 liter. Autoclaved and stored in the dark), 0.75 mL of 1 M CaCl2, and 0.75 mL of 1 M MgSO4.
Dauer pheromone plates for dose-response assay	Various		Mix 0.085 g Noble agar, 0.5 mL of 0.513 M NaCl and 5 µL of 5 mg/ml cholesterol dissolved in ethanol in each of 6x 15 mL culture tubes. Add sufficient crude pheromone to each tube to create a range of concentrations. Add H2O to bring the volume to 4.725 mL.  Boil over a Bunsen burner until the agar is dissolved and then cool to 55 °C. Add 125 µL 1 M KPO4 buffer (pH 6.0), 50 µl 0.1 M CaCl2, 50 µL 0.1 M MgSO4 and 50 µl of 5 mg/ml streptomycin sulfate to each tube.  Pour the contents of each tube into a 35 mm diameter Petri dish. Let the agar solidify at room temperature overnight (if longer, store in enclosed container to prevent excessive drying).
Microsphere beads 0.1 micron	Polysciences Inc.	00876-15
M9 buffer	Various		Mix 3 g KH2PO4, 6 g Na2HPO4, 5 g NaCl, 1 ml 1 M MgSO4, H2O to 1 liter. Sterilize by autoclaving