In-vivo-Imaging von Dauer-spezifische neuronale Remodeling in C. elegans

Summary

Following exposure to specific environmental stressors, the nematode Caenorhabditis elegans undergoes extensive phenotypic plasticity to enter into a stress-resistant ‘dauer’ juvenile stage. We present methods for the controlled induction and imaging of neuroplasticity during dauer.

Abstract

Die Mechanismen, die die Stress-induzierte phänotypische Plastizität bei Tieren sind häufig komplex und schwierig in vivo zu studieren. Ein klassisches Beispiel für stressinduzierten Plastizität ist die dauer Stufe C. elegans. Dauers sind eine Alternative Entwicklungslarvenstadium unter den Bedingungen der niedrigen Konzentrationen von bakteriellen Lebensmittel und hohe Konzentrationen einer dauer Pheromon gebildet. Dauers anzuzeigen umfangreichen Entwicklungs-und Verhaltensplastizität. Zum Beispiel kann ein Satz von vier inneren Lippen Quadranten (IL2Q) Neuronen in umfangreichen Umbau reversible während dauer Bildung. Unter Verwendung der bekannten Umwelt Wege Regel dauer Eintrag, einen vorher festgelegten Verfahren für die Herstellung von Roh-dauer Pheromon von großen Flüssigkeits Nematoden Kulturen demonstriert. Mit diesem Verfahren wird eine Konzentration von 50.000 – 75.000 Nematoden / ml des flüssigen Kultur ausreicht, um ein hochwirksames rohe Dauer Pheromon erzeugen. Das rohe Pheromon Potenz Detedurch eine Dosis-Wirkungs-Bioassay rmined. Schließlich sind die für die in vivo Zeitraffer-Bildgebung der IL2Qs während dauer Bildung verwendeten Methoden beschrieben.

Introduction

Phänotypische Plastizität, einschließlich Entwicklungs-und Verhaltensplastizität, ist wichtig für die Anpassung an widrige Umweltbedingungen und wird in der Evolution ¹ als treibende Kraft. C elegans ist ein Modellorganismus für Studien häufig in der Entwicklung und Neurobiologie eingesetzt. Unter idealen Bedingungen, C. elegans entwickelt sich durch vier Larvenstadien vor Eintritt in die Erwachsenenfortpflanzungsstadium. Doch unter den Bedingungen der niedrigen Verfügbarkeit von Nahrungsmitteln und eine hohe Bevölkerungsdichte, C. elegans kann eine Entwicklungs Schalter zu unterziehen und in einen langlebigen und strapazierfähigen dauer Stufe ^2. Dauers Anzeige mehrere morphologische und Verhaltensunterschiede von nicht-dauers die wahrscheinlich vermitteln diese Stressresistenz. Die Umweltreize und genetischen Signalwege regulieren dauer Eintrag haben ausführlich beschrieben ^{3, 4, 5, 6, 7} gewesen. Allerdings sind die molekularen Mechanismen, die die einzelnen phänotypischen Veränderungen, die auftreten, dährend dauer Bildung sind weniger gut verstanden.

Die Untersuchung der Dauer-spezifischen Phänotypen erfordert die Herstellung von Dauer-Tiere. Dies kann auf drei Arten durchgeführt werden: 1) Sammeln von einem ausgehungerten Kultur von C. elegans, 2) Verwendung von Dauer Bildung konstitutive (DAF-c) Mutanten, 3) Induktion der Dauer Bildung durch gereinigte Pheromon. Es ist relativ einfach, aus einem Standard-dauers NGM Platte mit einem C holen elegans Bevölkerung, die ihre bakterielle Lebensmittelversorgung erschöpft hat. In unseren Händen, ein Standard NGM Platte ursprünglich mit 50 ul OP50 Escherichia coli, darf für 3 Tage wachsen und anschließend mit 3 geimpft ausgesät – 4 Erwachsene Hermaphroditen bei 25 ° C gehalten wird die Nahrungsmittelversorgung innerhalb einer Woche verbrauchen und produzieren mehrere tausend dauers innerhalb von weiteren 3 Tagen (neben zahlreichen verhungert nicht dauers). Jedoch ist dieses Verfahren nicht zufriedenstellend für die Prüfung Vorgänge während der Häutung in d auftretendenAuer. Es ist schwierig zu bestimmen, welche der mehreren tausend Tieren auf einer typischen Platte in ausgehungert Dauer der Eingabe sind. Darüber hinaus wird die Verwendung eines verhungerten Platte bietet keine Möglichkeit für die Synchronisation. Die Verwendung von daf-c-Mutanten ermöglicht die Synchronisation und die zuverlässige Erzeugung von dauers. Es gibt jedoch keine Garantie, dass eine bestimmte daf-C-Mutation nicht alleine oder in Kombination mit weiteren Mutationen betreffen andere Dauer-spezifischen Phänotypen.

Das Vorhandensein einer Dauer Pheromon wurde zuerst von Cassada und Russell impliziert und später von Golden und Riddle gezeigt. Die Dauer Pheromon seitdem chemisch charakterisiert ^{2, 8, 9, 10.} Das gereinigte Pheromon besteht aus einer komplexen Mischung von ascarosides, die in verschiedenen Formen regulieren sowohl Verhaltens-und Entwicklungsprozesse ^{9, 11.} Verwendung einer rohen Dauer Pheromonextrakt ermöglicht zuverlässig gesteuert Induktion synchronisiert dauers in einem Wildtyp-Hintergrund. </p>

Das Nervensystem und die damit verbundenen Gliazellen Umbau unterzogen während dauer Larve Formation ^{12, 13, 14.} Einige dieser Änderungen sind irreversibel, wie der Umbau der Gliazellen während dauer ^{13, 14.} Jedoch andere Umbau Ereignisse sind reversibel bei einer Rückkehr zu günstigen Umgebungsbedingungen. Zum Beispiel ein Satz von vier IL2Q Neuronen unterziehen schnelle und reversible neuronale Umbau während dauer Bildung, einschließlich: Dendriten Verzweigung, einem Wechsel von Einzel dendritischen zu multidendritic Neuronen und Axonen Umbau ^12. Die Verfahren, die hier ermöglichen die In-vivo-Bildgebung von Stress-induzierten Neuroplastizität in einem Modellorganismus. Die für die Herstellung und Prüfung von Roh-dauer Pheromon stellten Verfahren sind zuvor beschrieben, und aus verschiedenen Quellen ^{4, 8, 15, 16, 17, 18} aufgelistet.

Protocol

1. Crude Dauer Pheromone Produktion Wachsen OP50 E. coli aus einer einzigen Kolonie O / N bei 37 ° C unter Schütteln in 100 ml LB-Brühe mit 200 Upm. ANMERKUNG: Diese O / N-Kultur kann im Voraus erfolgen und bei 4 ° C gelagert werden. Wachsen N2 C. elegans auf Juni 15-20 cm Petrischalen mit Agar NGM (siehe Rezept in Tabelle 1) ausgesät mit 50 ul OP50 E. coli, bis die Bakterien fast aufgebraucht ist 19. Machen 5x 250 ml S-Medien (siehe Rezept in Tab…

Representative Results

Die Produktion von Roh-dauer Pheromon zu einer gelben Flüssigkeit (Abbildung 1), die sowohl Wärme als auch Kälte stabil ist. Aliquots von Roh-Pheromon werden bei -20 ° C unbegrenzt ohne offensichtliche Aktivitätsverlust gelagert. Nach der Produktion von Pheromon, ist eine einzelne Dosis-Wirkungs-Bioassay ausreichend für eine grobe Schätzung der Potenz. Es ist jedoch für die meisten Experimente notwendig Bioassay 2 wiederholen – 3 Mal und die im Durchschnitt aus jedem Experiment. Repräsentative …

Discussion

Eine Untersuchung der Dauer-spezifische Neuroplastizität und andere dauer-assoziierten morphologischen Veränderungen erfordert kontrollierte und zuverlässige Bildung dauers entweder durch genetische Mutation (dh daf-c-Mutanten) oder durch Einwirkung von Wildtyp-Tiere Pheromon. Während die Verwendung eines genetischen Mutation dauers induzieren ist bequem, kann es Ergebnisse zu verwechseln. Daher Daten mit daf-c-Mutationen gesammelt sollte anschließend mit Wildtyp-Tiere veranlasst, die Dauer der B?…

Materials

N2 C. elegans Bristol strain	Caenorhabditis Genetics Center
PT2660 myIs13[Pklp-6::gfp] III	Upon request from Schroeder lab
PT2762 myIs14[Pklp-6::gfp] V	Upon request from Schroeder lab
JK2868 qIs56[Plag-2::gfp] V	Caenorhabditis Genetics Center
OP50 E. coli	Caenorhabditis Genetics Center
Petri dishes	Tritech Research	60 mm T3308, 35 mm T3501
NGM agar	Various		3 g NaCl, 17 g agar, 2.5 g peptone in 975 mL H2O autoclaved cooled to 55°C followed by 1 mL of 5 mg/ml cholesterol in ethanol, 25 mL of 1 M KPO4 buffer (pH 6.0), 1 mL of 1 M CaCl2, 1 mL of 1 M MgSO4
S Media	Various		S media consists of S basal solution (1.46 g NaCl, 0.25g K2HPO4, 1.5 g KH2PO4, 0.25 ml of 5 mg/ml cholesterol in ethanol and H2O to 250 mL. Autoclaved.) To the S basal solution add 2.5 mL of potassium citrate pH 6.0 (2 g citric acid monohydrate, 29.4 g tri-potassium citrate monohydrate, H2O to 100 mL, autoclaved), 2.5 mL of Trace Metals Solution (1.86 g disodium EDTA, 0.69 g FeSO4 •7 H2O, 0.2 g MnCl2•4 H2O, 0.29 g ZnSO4 •7 H2O, 0.025 g CuSO4 •5 H2O, H2O to 1 liter. Autoclaved and stored in the dark), 0.75 mL of 1 M CaCl2, and 0.75 mL of 1 M MgSO4.
Dauer pheromone plates for dose-response assay	Various		Mix 0.085 g Noble agar, 0.5 mL of 0.513 M NaCl and 5 µL of 5 mg/ml cholesterol dissolved in ethanol in each of 6x 15 mL culture tubes. Add sufficient crude pheromone to each tube to create a range of concentrations. Add H2O to bring the volume to 4.725 mL.  Boil over a Bunsen burner until the agar is dissolved and then cool to 55 °C. Add 125 µL 1 M KPO4 buffer (pH 6.0), 50 µl 0.1 M CaCl2, 50 µL 0.1 M MgSO4 and 50 µl of 5 mg/ml streptomycin sulfate to each tube.  Pour the contents of each tube into a 35 mm diameter Petri dish. Let the agar solidify at room temperature overnight (if longer, store in enclosed container to prevent excessive drying).
Microsphere beads 0.1 micron	Polysciences Inc.	00876-15
M9 buffer	Various		Mix 3 g KH2PO4, 6 g Na2HPO4, 5 g NaCl, 1 ml 1 M MgSO4, H2O to 1 liter. Sterilize by autoclaving