In vivo ההדמיה של דאואר ספציפי עצבי שיפוץ בג elegans

Summary

Following exposure to specific environmental stressors, the nematode Caenorhabditis elegans undergoes extensive phenotypic plasticity to enter into a stress-resistant ‘dauer’ juvenile stage. We present methods for the controlled induction and imaging of neuroplasticity during dauer.

Abstract

מנגנוני השליטה פלסטיות פנוטיפי שנגרם עקב מתח בבעלי חיים הם לעתים קרובות מורכבים וקשים ללמוד in vivo. דוגמא קלאסית של פלסטיות שנגרם עקב מתח היא שלב dauer של ג elegans. Dauers הוא שלב זחל התפתחותית חלופי נוצר בתנאים של ריכוזים נמוכים של חיידקים שבמזון וריכוזים גבוהים של פרומון dauer. Dauers להציג פלסטיות התפתחות והתנהגות נרחבת. לדוגמא, קבוצה של ארבעה רביע פנימי labial הנוירונים (IL2Q) עוברים שיפוץ הפיך נרחב במהלך היווצרות dauer. ניצול הכניסה הידועה dauer ויסות מסלולים סביבתיים, שיטה הוקמה בעבר לייצור פרומון dauer הגולמי מתרבויות נמטודות נוזל בקנה מידה גדולה הוא הוכיח. בשיטה זו, ריכוז של 50,000 – 75,000 / נמטודות מ"ל של תרבות הנוזלית הוא מספיק כדי לייצר פרומון dauer הגולמי חזק מאוד. עצמת פרומון הגולמי היא determined ידי המבדק מנת תגובה. לבסוף, השיטות המשמשות בזמן לשגות הדמיה vivo של IL2Qs במהלך היווצרות dauer מתוארות.

Introduction

פלסטיות פנוטיפי, כוללים פלסטיות התפתחות והתנהגות, חשובה להסתגלות לתנאי סביבה שליליות ולנחשב לכוח מניע בהתפתחות ^1. ג elegans הוא אורגניזם מודל המשמש לעתים קרובות ללימודים בפיתוח ונוירוביולוגיה. בתנאים אידיאליים, ג elegans מתפתח דרך ארבעה שלבי זחל לפני כניסת שלב הרבייה הבוגרת. עם זאת, בתנאים של זמינות נמוכה מזון וצפיפות אוכלוסייה גבוהה, ג elegans יכול לעבור מתג התפתחותיים ולהיכנס לשלב dauer חיים ארוך ועמידות לעקות ^2. Dauers להציג כמה הבדלים מורפולוגיים והתנהגותיים מאינם dauers אשר צפוי לתווך התנגדות ללחץ הזה. הרמזים הסביבתיים ומסלולים גנטיים המסדירים כניסת dauer היו תיארו בהרחבה ^{3, 4, 5, 6, 7.} עם זאת, המנגנונים המולקולריים שליטה שינויי פנוטיפי בודדים המתרחשים דהיווצרות dauer uring הם הבינו פחות טוב.

הבדיקה של פנוטיפים dauer ספציפי דורשת הייצור של בעלי החיים dauer. זה יכול להיות מושלם בשלוש דרכים: 1) בחירה מתרבות מורעבת של ג elegans, 2) שימוש בהיווצרות dauer (daf-c המכונן) מוטציות, 3) אינדוקציה של היווצרות dauer באמצעות פרומון מטוהר. זה פשוט יחסית כדי לאסוף dauers מצלחת NGM סטנדרטית עם ג אוכלוסיית elegans שמיצתה את מזון אספקת החיידקים שלה. בידיים שלנו, צלחת NGM סטנדרטית במקור זרע עם 50 μl של Escherichia coli OP50, מותר לגדול במשך 3 ימים ולאחר מכן מחוסן עם 3 – הרמפרודיטים 4 מבוגרים המשיך ב25 ° C יתיש אספקת מזון בתוך שבוע אחד ולייצר כמה אלף dauers בתוך 3 ימים נוספים (בנוסף למים שאינם dauers מורעב רב). עם זאת, שיטה זו אינה מניחה את הדעת לתהליכי בחינה המתרחשים במהלך הנשירה לדאאואר. קשה לקבוע איזו מכמה אלף בעלי חיים על צלחת מורעבת טיפוסית נכנסים לdauer. יתר על כן, שימוש בצלחת מורעבת מציעה שום אפשרות לסנכרון. השימוש במוטציות daf-c מאפשרים סנכרון והדור אמין של dauers. עם זאת, אין ערובה לכך שמוטצית daf-c בפרט לא תשפיע פנוטיפים dauer ספציפי אחרים לבד או בשילוב עם מוטציות נוספות.

הנוכחות של פרומון dauer נרמזה לראשונה על ידי Cassada וראסל ומאוחר יותר לידי הביטוי בזהב וחידה. פרומון dauer מאז מאופיין כימי ^{2, 8, 9, 10.} פרומון המטוהר מורכב מתערובת מורכבת של ascarosides, אשר בצורות שונות להסדיר שני תהליכים התנהגותיים והתפתחותיים ^{9, 11.} שימוש בתמצית פרומון dauer הגולמי מאפשרים אינדוקציה אמינה מבוקרת של dauers המסונכרן ברקע wild-type. </p>

מערכת העצבים ותאי גליה הקשורים לעבור שיפוץ במהלך זחל dauer היווצרות ^{12, 13, 14.} חלק משינויים אלה הם בלתי הפיכים, כגון שיפוץ של תאי גליה במהלך dauer ^{13, 14.} עם זאת אירועי שיפוץ אחרים הם הפיכים על שיבה לחיובית תנאים סביבתיים. לדוגמא, קבוצה של ארבעה נוירונים IL2Q לעבור שיפוץ עצבי מהיר והפיך במהלך היווצרות dauer כולל: arborization דנדריט, מתג מהדנדריטים יחידים לתאי עצב והאקסון multidendritic שיפוץ ^12. השיטות בזאת לאפשר להדמית in vivo אמינה של neuroplasticity מתח מושרה באורגניזם מודל. השיטות שהוצגו לייצור והבדיקה של פרומון dauer גולמי שתוארו קודם לכן, ונאספו מכמה מקורות ^{4, 8, 15, 16, 17, 18.}

Protocol

.1 גולמי דאואר פרומון הפקה לגדול OP50 E. coli מO מושבה אחת / N על 37 מעלות צלזיוס בזמן רועד בשל מרק LB 100 מ"ל ב 200 סל"ד. הערה: O / תרבות N זה יכול להתבצע מראש ולאחסן ב 4 ° C.. לגדול N2 ג elegans על 15-20 י…

Representative Results

הייצור של תוצאות פרומון dauer הגולמי בנוזל צהוב (איור 1) שהוא גם חום ויציב קר. Aliquots של פרומון גולמי מאוחסנים ב -20 ° C ללא הגבלת זמן ללא הפסד ברור בפעילות. בעקבות הייצור של פרומון, המבדק מנת תגובה אחת מספיק להערכה גסה של עוצמה. עם זאת, עבור רוב הניסויים יש צורך לחזור ?…

Discussion

בדיקה של neuroplasticity dauer ספציפי ושינויים מורפולוגיים הקשורים dauer אחרים דורשת מבוקרת והיווצרות אמינה של dauers או באמצעות מוטציה גנטית (מוטציות כלומר, daf-ג) או על ידי חשיפה של חיות בר מהסוג לפרומון. בעוד שהשימוש במוטציה גנטית כדי לגרום dauers הוא נוח, הוא עשוי לבלבל את התוצא?…

Materials

N2 C. elegans Bristol strain	Caenorhabditis Genetics Center
PT2660 myIs13[Pklp-6::gfp] III	Upon request from Schroeder lab
PT2762 myIs14[Pklp-6::gfp] V	Upon request from Schroeder lab
JK2868 qIs56[Plag-2::gfp] V	Caenorhabditis Genetics Center
OP50 E. coli	Caenorhabditis Genetics Center
Petri dishes	Tritech Research	60 mm T3308, 35 mm T3501
NGM agar	Various		3 g NaCl, 17 g agar, 2.5 g peptone in 975 mL H2O autoclaved cooled to 55°C followed by 1 mL of 5 mg/ml cholesterol in ethanol, 25 mL of 1 M KPO4 buffer (pH 6.0), 1 mL of 1 M CaCl2, 1 mL of 1 M MgSO4
S Media	Various		S media consists of S basal solution (1.46 g NaCl, 0.25g K2HPO4, 1.5 g KH2PO4, 0.25 ml of 5 mg/ml cholesterol in ethanol and H2O to 250 mL. Autoclaved.) To the S basal solution add 2.5 mL of potassium citrate pH 6.0 (2 g citric acid monohydrate, 29.4 g tri-potassium citrate monohydrate, H2O to 100 mL, autoclaved), 2.5 mL of Trace Metals Solution (1.86 g disodium EDTA, 0.69 g FeSO4 •7 H2O, 0.2 g MnCl2•4 H2O, 0.29 g ZnSO4 •7 H2O, 0.025 g CuSO4 •5 H2O, H2O to 1 liter. Autoclaved and stored in the dark), 0.75 mL of 1 M CaCl2, and 0.75 mL of 1 M MgSO4.
Dauer pheromone plates for dose-response assay	Various		Mix 0.085 g Noble agar, 0.5 mL of 0.513 M NaCl and 5 µL of 5 mg/ml cholesterol dissolved in ethanol in each of 6x 15 mL culture tubes. Add sufficient crude pheromone to each tube to create a range of concentrations. Add H2O to bring the volume to 4.725 mL.  Boil over a Bunsen burner until the agar is dissolved and then cool to 55 °C. Add 125 µL 1 M KPO4 buffer (pH 6.0), 50 µl 0.1 M CaCl2, 50 µL 0.1 M MgSO4 and 50 µl of 5 mg/ml streptomycin sulfate to each tube.  Pour the contents of each tube into a 35 mm diameter Petri dish. Let the agar solidify at room temperature overnight (if longer, store in enclosed container to prevent excessive drying).
Microsphere beads 0.1 micron	Polysciences Inc.	00876-15
M9 buffer	Various		Mix 3 g KH2PO4, 6 g Na2HPO4, 5 g NaCl, 1 ml 1 M MgSO4, H2O to 1 liter. Sterilize by autoclaving